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反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、B 1 和B 2 的浓度

来源:中华现代临床医学杂志 作者:李映章 张志宇梁晟楠 2005-9-22
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摘要: 水溶性维生素与人体的生长发育和健康有着密切关系,在人体的生命活动中具有十分重要的作用,它们在人体内的含量是衡量一个人的健康指标。目前VitC,VitB 1 和VitB 2 传统测定方法中,VitC常用2,4-二硝基苯肼比色法和2,6-二氯靛酚钠盐滴定,这两个方法灵敏度较低,特异性差,目前一般科研项目都不采用这个滴定法。Vit B......


  水溶性维生素与人体的生长发育和健康有着密切关系,在人体的生命活动中具有十分重要的作用,它们在人体内的含量是衡量一个人的健康指标。目前VitC,VitB 1 和VitB 2 传统测定方法中,VitC常用2,4-二硝基苯肼比色法和2,6-二氯靛酚钠盐滴定,这两个方法灵敏度较低,特异性差,目前一般科研项目都不采用这个滴定法;Vit B 1 和Vit B 2 可用荧光法,但该法前期处理操作繁冗,费时费力,其处理方法和过程增加了影响检测精确度欠佳的人为因素。本文数据采用液相色谱法分离检测。

  1 实验部分
   
  1.1 仪器 SY5000LIQUID CHROMATOGRAPII(BEIFN)具UV/VIS检测器,色谱柱:Lichrosphcr C18,4.6×250,5μm,TL9900色谱数据工作站。
    
  1.2 试剂 本实验所用水为石英亚沸蒸馏水,以0.45μm水性微孔滤膜过滤。所用试剂均为分析纯(AR),甲醇为一级色谱纯,标样维生素C、B 1 、B 2 贮备液以0.01mol/L草酸配制,在4℃冰箱中保存。VitC临用新配。流动相A:0.05ml/L KH 2 PO4缓冲液(pH6.00);流动相B:甲醇。均经0.45μm水性微孔滤膜过滤,超声波脱气后使用。整个操作应避光,且操作过程要迅速,以防维生素被氧化。
   
  1.3 样品处理 检测学生起床后将昨晚尿排空,空腹以200ml水送服VitC500mg,VitB 1 5mg和VitB 2 5mg,然后收集服药后4h内排出的尿于1000ml广口棕色瓶中,并加4%的草酸防护,尿液经0.45μm微孔过滤器过滤 [4]  ,超声波脱气后即可上色谱柱分离检测。
   
  1.4 色谱仪工作条件 色谱检测的流动相由磷酸二氢钾A和甲醇B组成,其比例为90∶10和65∶35。流速1.0ml/min,柱温:室温,波长:266nm,柱前压:168~240ATM。
   
  1.5 标准曲线制作 配制一系列不同浓度的混合液,经检测得出的数据作出如下3种维生素的标准曲线(如图1示)。

  1.6 色谱检测 分时间段采样,每采一批样有30个左右尿样。样品处理后,按标准样品检测的条件,以外标法检测VitC、VitB 1 和VitB 2 ,经TL9900色谱数据工作站处理检测出的数据和图形。

  2 检测结果
   
  经检测,得出样品中所含3种维生素的量,通过分析可得出如下结果(图2为一个样品的VitC、VitB 1 和VitB 2 3种维生素的色谱分析图):
   
  色谱法检测得此样品中VitC、VitB 1 和VitB 2 的峰高分别为1805mV、40mV和386mV,从标准曲线计算出其4h内排出尿样中的三种维生素的量分别为2.58mg、0.44mg和0.42mg。从五个斑151个尿样检测结果来看,VitC缺乏的占检测总数的15.23%,不足的占13.90%,正常的占70.87%;VitB 1 缺乏的占1.99%,不足的占3.31%,正常的占94.70%;VitB 2 不足的占16.56%,正常的占52.31%,良好的占31.13%(正常以上的占83.44%) [1]  。

  3 讨论与总结
   
  3.1 检测波长的选择 待检测的3种维生素中,VitC在261nm,VitB 1 在246nm,VitB 2 在260nm波长处有最大的吸收 [2,3]  ,本次实验曾分别选用以上3种波长检测这三种维生素混合液,以上波长都不是这3种维生素混合液的最大吸收波长,经试验,最后确定266nm波长为三种待检测维生素的最佳检测波长。
   
  3.2 回收率 测得人体尿样的3种维生素的含量,再加入已知浓度的标准品,混合后按1.6项操作,测其含量,得出其平均回收率的范围是90.12%~99.85%,变异系数在1.98%~6.56%之间,说明此种方法检测人体尿样中的维生素C、B 1 和B 2 3种水溶性维生素的含量是可靠的。
   
  3.3 流动相确定 流动相由磷酸二氢钾缓冲液和甲醇组成,本实验曾以不同比例的流动相和波长对3种维生素C、B 1 、B 2 进行反复分离检测。通过实验,最终摸索出检峰形好,保留时间短的流动相组成比例。在磷酸二氢甲缓冲液∶甲醇=90∶10情况下,VitC保留时间在2.280~2.300min之内,VitB 1 在5.250~5.400min之内,VitB 2 在20min之后。此种情况分析一个的混合样至少需要25min(含平衡时间)。 在流动相比例65∶35的情况下,VitB 1 保留时间9.120~9.310min。中VitC和VitB 1 出峰不好,拖尾严重。本实验曾试行以梯度洗脱法检测,可将3种维生素分开,但检测时间长,至少在25min以上,且出现拖尾情况。考虑到本实验要检测的样品数目多,需以尽快的速度检测,故采取分步检测法:在流动相比例90∶10和65∶35情况下分别检测VitC、VitB 1 和VitB 2 ,两次检测合计不用20min,且它们分离得好,波型都是VV波型。
   
  3.4 标准样品溶剂的选择 在VitC、VitB 1 和VitB 2 的标准溶液配制中,本实验曾采用盐酸、偏磷酸和草酸作溶剂。从实验情况来看,草酸是以上3种维生素较好的溶剂,其获得检测数据误差小,检测波型好,这可能是草酸对VitC、VitB 1 和VitB 2 具有更好的稳定作用。
   
  3.5 流速 流速对检测精确度影响不大,但对检测保留时间影响较大。如流速1.0ml/1min,柱前压稍大一些,在200~240ATM之间,但仪器仍然可承受;如果流速变小,如0.8ml/min,虽然柱前压随之变小,约168atm,但保留时间却延迟5~10min,这对要检测大量样品是不可取的。故本实验采用1.0ml/min流速。
   
  3.6 待检样品处理的注意事项 由于维生素类物质稳定性不好,样品在检测之前,加入适当的保护剂,力求低温保存,防强光照,争取在最短时间内进行检测,以防维生素被氧化。这些都是取得较高检测精确度的重要性举措。
   
  3.7 总结 液相色谱法检测快捷,特异性好,灵敏度高;加上仪器具有色谱数据工作站软件,对数据和图形处理极为方便。故该方法是检测维生素物质的理想方法。

  (本文图片资料见附页2)(略)

  参考文献
    
  1 于守祥,刘志诚.营养与食品卫生监督检测方法指南.北京:人民卫生出版社,1980,9.
   
  2 潘建国,王开发.高效液相色谱法同步测定花粉中的水溶性维生素.上海:同济大学出版社,2001,581-583.
   
  3 成志强,孙成均.反相高效色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素.分析化学,2001,(9):1068-1071.
   
  4 陈永明,刘放南.反相高效液相色谱法测定血中维生素C浓度.肠外与肠内营养,1998,(3):163-164.
    
  (收稿日期:2004-06-10)

  (编辑秋 实) 

  ˇ 基金项目:广东省教育九五规划科研课题“大学生营养监测与干预”(项目编号:JYA02021)
   
  作者单位:510225广东广州仲恺农业技术学院医疗中心( △ 实验中心) 


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