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维生素A对SD大鼠食欲及下丘脑神经肽Y基因表达的影响

来源:《中国学校卫生》 作者: 2009-8-25
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摘要: 【摘要】 目的 探讨维生素A对SD大鼠食欲和下丘脑神经肽Y基因表达的影响,初步探讨维生素A影响大鼠食欲的机制。方法 将雄性SD大鼠随机分为2组:A组(维生素A缺乏组)和B组(对照组)。喂养74 d,A组随机取出16只,分为2组:A1组(维生素A缺乏组)和A2组(维生素A皮下补充组)。实验79 d,将这3组大鼠全部处死,取血和......


【摘要】    目的 探讨维生素A对SD大鼠食欲和下丘脑神经肽Y基因表达的影响,初步探讨维生素A影响大鼠食欲的机制。方法 将雄性SD大鼠随机分为2组:A组(维生素A缺乏组)和B组(对照组)。喂养74 d,A组随机取出16只,分为2组:A1组(维生素A缺乏组)和A2组(维生素A皮下补充组);B组随机取出8只,为B1组(对照组)。实验79 d,将这3组大鼠全部处死,取血和组织进行相关指标测定。A组剩余的动物按体重随机分为2组:A3组(维生素A缺乏组)和A4组(维生素A食物补充组)。B组剩余的8只动物为B2组(对照组)。30 d后将其全部处死,取血和组织进行相关指标测定。结果 维生素A缺乏组进食量显著低于正常对照组,给予缺乏组大鼠维生素A皮下和食物补充后,大鼠进食量显著增多。维生素A缺乏组下丘脑神经肽Y mRNA表现为低表达,皮下补充维生素A后大鼠下丘脑神经肽Y mRNA的表达水平明显升高。结论 维生素A影响大鼠食欲的可能机制是改变了下丘脑有关控制食欲的基因表达。

【关键词】  维生素A;大鼠;食欲;精神肽Y;基因表达

  Effect of Vitamin A on Appetite and Gene Expression of NPY in Rats

  LU Xiaomei, XU Jida, AO Shuqing, et al.

  Public Health School of Nanjing Medical University, Nanjing(210029), China

    【Abstract】Objective  To investigate the effects of vitamin A on appetite and the gene expression of neuropeptide Y(NPY), and to explore the mechanism of vitamine A on rats'  appitite. Methods  Male SprgueDawley rats were divided into two groups: A(vatamin A deficient group), B(vitamin A normal control group). Both of the two groups were given a diet deficient in vitamin A, 74 days later, 16 rats were selected from group A and then divided into two groups: A1(vitamin A deficient group), A2(vitamin A administration group). Also 8 rats were selected from group B as B1(vitamin A normal control group). At the 79th day, all the rats in the three groups were killed, and some relevant indices were measured. The rest rats in group A were divided into two groups sagain: A3(vitamin A deficient group), A4(vitamin A supplement group). The rest 8 rats in group B was B2(vitamin A normal control group). All the rats were killed after 30 days. Some relevant indices were also measured. Results  In the VAD group, the total food intake was significantly lower than that of the control group. After giving Vitamin A supplement, the total food intake obviouly increased. The expression of NPY in VAD group was decreased while it was enhanced obviously in A2 group. Conclusion  Vatamin A affect the expression of related appetite regulator, resulting in the change of food intake.

    【Key words】Vitamin A; Rats; Appetite; Neuropepide Y; Gene expression

  维生素A是小儿生长发育的必需营养素,早在20世纪70年代,就有学者指出,维生素A与食欲关系密切。研究人员在对厌食儿童的研究中发现,病例组的维生素A水平明显低于对照组,暗适应时间明显延长,认为维生素A与儿童食欲有相关关系[1]。本实验通过为期103 d的动物实验,探讨维生素A缺乏与补充对大鼠食欲的影响及下丘脑控制食欲有关基因的表达,初步探讨维生素A影响大鼠食欲的机制。

  1  材料与方法

  1.1  材料

  1.1.1  试剂和仪器 

  维生素A(美国Acros Organics)、全反式视黄酸(美国Sigma)、高效液相色谱仪(美国Waters公司)、紫外可见光分光光度计(DU650, 美国BECKMANDU)、水平电泳槽(美国Bio-Rad)、凝胶成像系统(江苏捷达)、7000荧光定量PCR仪(美国ABI公司)

  1.1.2  动物饲料配方及制作 

  基础配方(表1)原则参照美国营养学会(AIN)-93G纯化饲料[2]要求及文献略加改良。其中所含营养素和能量保证大鼠生长发育的基本要求。在此基础上减去维生素A含量,配置成维生素A缺乏颗粒状饲料。表1  基础饲料配方(略)

    制作饲料前将结晶状矿物盐磨成粉状,然后与其他无机盐混匀,确保达到最小颗粒用于配置饲料。配饲料时首先将原料称好,将油、混合维生素、混合矿物质分别用少量淀粉充分混匀,然后将3种混合物与小量大宗原料混合,再逐步扩大混合,以达到充分混匀[3]。饲料加工成颗粒状饲料,加工过程中严格控制温度,加工后用辐照灭菌。对加工好的饲料进行维生素A检测[4],维生素A含量远远低于45 μg/kg,已低于可检测水平,未能检出,近似为零。

  1.2  方法

  1.2.1  动物分组 

  健康雄性21~23 d断乳期SD大鼠48只,(上海斯莱克实验动物有限责任公司),清洁级,动物合格证号:SCXK(沪)2003-0003。实验动物随机分为2组:A组,32只,为维生素A缺乏组(VAD组);B组,16只,为维生素A正常对照组(B组,Control组)。2组大鼠均给予维生素A缺乏饲料,见表1。缺乏组大鼠用菜籽油按1 mL/kg灌胃,正常对照组维生素A的补充剂量为每在18 μg/kg体重[2],按1 mL/kg灌胃。2组平均体重分别为:A组, (80.38±4.87) g;B组, (81.69±4.05)g, 组间差异无统计学意义。实验第74天,A组动物随机取出16只,分为2组:A1组,维生素A缺乏组,8只,皮下注射菜籽油,剂量为50 mg/kg;A2组,维生素A皮下补充组,8只,皮下注射全反式视黄酸(ATRA),剂量为50 mg/kg。B组动物随机取出8只,B1组,为正常对照组,皮下注射菜籽油,剂量为50 mg/kg,连续注射4 d,实验第79天 ,将这3组大鼠全部处死,取血和组织行相关指标的测定。A组剩余的动物按体重随机分为2组:A3组,为维生素A继续缺乏组;A4组,为维生素A食物补充组。B组剩余的动物为B2组,是维生素A正常对照组,3组大鼠均给予维生素A缺乏饲料,A3组大鼠用菜籽油按1 mL/kg灌胃,A4组和B2组大鼠维生素A的补充剂量为每天18 μg/kg体重,按1 mL/kg灌胃,每组动物8只。30 d后将其全部处死,取血和组织进行相关指标测定。实验动物分笼饲养,动物房温度控制在16~25℃,湿度为55%~65%,所有动物自由进食,饮用自来水。

  1.2.2  标本采集 

  隔日记录给食量和剩余量,每周定时称重2次,并观察记录动物活动。分别于实验的第78天和第104天处死动物(处死前12 h空腹),取血清、肝脏,并留取脑组织迅速放入液氮后转移至-70℃冰箱保存以备检测mRNA。

  1.2.3  realtime-PCR法检测基因表达量 

  按Trizol说明书方法提取下丘脑组织总RNA,经紫外可见光分光光度计测定RNA浓度后,逆转录成cDNA,进行PCR扩增。PCR反应以逆转录产物为义务模板,引物序列见表2。引物由上海英峻生物技术有限公司合成。以β-actin为内对照,通过实时荧光定量PCR方法,检测维生素A干预前后基因NPY表达差异[5]。反应体系:cDNA 1 μL ,上游引物 0.2 μL,下游引物0.2 μL, Evagreen μL, dNTPs 0.6 μL,10×PCR Buffer2 μL, Mgcl2 (25mmol/L)  2 μL, Taq DNA Polymerase (5U/L) 0.2 μL,加无菌水至20 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s(NPY,58 ℃, β-actin,60 ℃),退火40 s,72 ℃延伸45 s,共45个循环;72 ℃后延伸10 min。表2  β-actin与NPY基因引物序列(略)

  1.3  数据处理 

  实验数据以均数±标准差表达(x±s),采用Stata 7.0统计软件包对数据进行统计分析。2组间比较用t检验,3组间比较用单因素方差分析,以P<0.05为显著性差异水准。

  2  结果

  2.1  维生素A缺乏大鼠的一般体征 

  喂养12周末,与正常组比较,VAD组大鼠出现皮毛粗糙、光泽较差、竖毛、眼睛畏光、有眼分泌物,但未观察到角膜溃疡、失明等眼部体征。

  2.2  实验各期各组大鼠进食量情况 

  VAD缺乏组大鼠自第4周起,进食量显著低于对照组,见表3。在维生素A皮下补充实验中(4 d),第1天3组大鼠进食量差异无统计学意义,第2,3,4天VAD组大鼠进食量显著低于正常对照组和Vitamin A皮下补充组,Vitamin A皮下补充组第2,3天进食量显著低于正常对照组,至第4天2组大鼠进食量无明显差异(P>0.05),见表4。表5显示,在维生素A食物补充实验全程中,VAD大鼠的进食量显著低于正常对照组和Vitamin A食物补充组(P值均<0.05),Vitamin A食物补充组的进食量与正常对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。表3  维生素A缺乏实验2组大鼠摄食量变化情况(略)注:*与B组比较,P<0.05。表4  维生素A皮下补充实验3组大鼠摄食量变化情况(略)注:a与VA皮下补充组比较,P<0.01; b.与B组比较,P<0.01。表5  维生素A食物补充实验3组大鼠摄食量变化情况(略)注:a.与B组、VA食物补充组比较,P<0.01。

  2.3  实验期间各组大鼠体重变化趋势 

  在维生素A缺乏实验过程中,VA缺乏组大鼠体重和正常对照组差异无统计学意义。在维生素A皮下补充实验中,前2天3组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05),实验的第3,4天,VA缺乏组大鼠体重显著低于正常对照组(P值均<0.05),见表6。在维生素A食物补充过程中,3组大鼠体重差异无统计学意义(P值均>0.05)。表6  维生素A皮下补充实验大鼠体重变化情况(略)注:*与B组比较,P<0.05。

  2.4  实验各期各组大鼠维生素A含量情况 

  皮下补充维生素A实验结果显示:VAD组血清和肝脏维生素A值显著低于正常对照组;皮下补充后,与缺乏组相比,大鼠血清维生素A值显著升高,肝脏维生素A值无明显改变。但皮下补充组血清仍显著低于正常对照组。见表7。食物补充维生素A实验结果显示:VAD组血清和肝脏维生素A值均显著低于正常对照组和维生素A食物补充组;维生素A食物补充组肝脏维生素A值低于正常对照组,差异统计学意义(P<0.01)。见表8。表7  维生素A皮下补充实验3组大鼠维生素A含量比较(略)注:a.与B组比较,P<0.01,b.与VAD组比较,P<0.01。表8  维生素A食物补充实验中各组大鼠维生素A含量(略)注:a.与B组、维生素A食物补充组比较,P<0.01;b.与B组比较,P<0.05。

  2.5  实验期间各组大鼠NPY mRNA表达情况 

  维生素A皮下补充实验相对实时定量结果表明,正常对照组的增食肽NPY mRNA的表达是缺乏组的12.47倍。给予维生素A皮下补充后,皮下补充组大鼠NPY mRNA的表达显著升高(图1);在维生素A食物补充实验中,相对实时定量结果表明,正常对照组的食欲促进因子NPY mRNA也存在高表达,是缺乏组的3.94倍(图2)。

  3  讨论

    研究发现,下丘脑中散在分布着数个调节摄食行为的关键区,如下丘脑外侧区(LH)、腹内侧核(VMN)、弓状核(ARC)、室旁核(PVN)等,它们协同合作、相互影响,形成了一个复杂的“食欲调节网络(ARN)”,其中众多的食欲调节因子(包括多种食欲促进因子和抑制因子)起着极其重要的信息传递作用。在下丘脑食欲调节网络中,NPY是下丘脑中最重要的食欲促进因子,神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一种含有36个氨基酸的多肽,于1982年由Tatemoto首先从猪脑中分离出来,属胰多肽家族,广泛分布于体内,尤以神经系统含量最高。将NPY微量注入不同的下丘脑区皆可刺激动物的摄食活动。研究发现,厌食患儿血浆NPY水平低于正常儿。NPY是一个天然存在的食欲信息传递因子,对多种食欲促进因子和抑制因子具有调节作用。NPY 是leptin、orexin和Ghrelin 3种摄食调控因子的直接作用对象,是这些摄食调控因子发挥作用的重要桥梁[6]。

    实验发现,维生素A缺乏组大鼠下丘脑组织NPY mRNA为低表达,正常对照组NPY mRNA的表达水平是缺乏组的12.47倍,给予VAD组大鼠维生素A皮下补充后,NPY mRNA的表达明显升高。这充分说明了在为期4 d的维生素A皮下补充实验过程中,缺乏组大鼠进食量明显下降时,皮下补充组大鼠进食量没有下降,较缺乏组显著升高,且维持和正常对照组相同的水平。给予VAD组大鼠食物补充维生素A后,NPY mRNA水平有了一定的升高,但升高倍数较小,因此,NPY可能不是维生素A皮下补充实验中引起大鼠食欲改变的主要调节基因,可能还有其他食欲调节因子的参与。近年来,随着医学进展,发现越来越多的食欲调控信号,如饱食信号瘦素(leptin)、胆囊收缩素(CCK)、蛙皮素(bombesin)、胰岛素(insulin)等,饥饿信号增食欲素(orexin)、甘丙肽(galanin)等。目前还不知道维生素A是直接促进下丘脑NPY的合成,还是通过外周激素如瘦素、胰岛素、糖皮质激素等间接影响NPY的合成,其机理还需进一步探索。

    维生素A是小儿生长发育的必需营养素,维生素A缺乏不仅可引起失明等眼部症状[7],还能损害机体的免疫系统,极大地增加患病和死亡的危险[8-10]。本文初步探讨维生素A缺乏与补充影响食欲的可能机制,旨在为儿童厌食症的预防和治疗提供新的思路,更好地促进儿童生长发育,保障儿童身心健康。

【参考文献】
    [1]黄玉春,姜英,王福先. 厌食儿童维生素A营养状况的研究. 中国儿童保健, 1994, 2(4): 255-256.

  [2]REEOES PG,NIETSEN FH,FAHEY GC,et al.IN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American institute of nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr,1993,123(11):1 939-1 951.

  [3]葛可佑. 中国营养科学全书 . 北京: 人民卫生出版社,2004:667.

  [4]GB/T 5009. 82-2003, 食品中维生素A和维生素E的测定.

  [5]LIVAK KJ. SCHMITTGEN TD. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2[-Delte Delta CCT] Method. Methods,2001,25(4):402-408.

  [6]KOHNO D,GAO HZ,MUROYA S,et al.Ghrelin directly interacts with neuropeptideYcontaining neurons in the rat arcuate nucleus:Ca2+ sinaling via protein kinase A and Vtype channledependent naechanisms and crosstalk with leptin and orexin. Diabetes,2003,52(4):948-956.

  [7]SOMMER A, TARWOTJO I, HUSSAINI G. Incidence, prevalence and scale of blinding malnutrition. Lancet, 1981,1(8 235):1 407-1 408.

  [8]联合国儿童基金会. 世界儿童状况.纽约:牛津大学出版社,1990.

  [9]SOMMER A, TARWOTJO I, DJUANAEDI E,et al. Impact of vitamin A supplementation on childhood mortality: A randomized, controlled community trial. Lancet, 1986,1(8 491),:1 169-1 173.

  [10]MUHILAL, PERMEISIH D, IDJRADINATA YR, et al. Vitamin A fortified monosodium glutamate and health, growth, and survival of children: a controlled field trial. Am J Clin Nutr, 1988, 48(5): 1 271-1 276.


作者单位:1 南京医科大学公共卫生学院教学实验中心,江苏 210029;2 南京医科大学康达学院。


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