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成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定

来源:《中国矫形外科杂志》 作者: 2009-8-24
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摘要: 【摘要】 [目的] 建立成人退变髓核细胞的单层培养模型并观察其形态。测定其细胞周期,探讨传代后髓核细胞生长不佳的原因。[方法] 取24例椎间盘突出症患者手术切除的椎间盘组织,分离出髓核组织,胰酶和胶原酶消化,DMEM/12培养基培养。倒置相差显微镜观察其形态学特征,流式细胞分析仪检测原代和P2细胞周期。...


【摘要】  [目的] 建立成人退变髓核细胞的单层培养模型并观察其形态;测定其细胞周期,探讨传代后髓核细胞生长不佳的原因。[方法] 取24例椎间盘突出症患者手术切除的椎间盘组织,分离出髓核组织,胰酶和胶原酶消化,DMEM/12培养基培养。倒置相差显微镜观察其形态学特征,流式细胞分析仪检测原代和P2细胞周期。[结果](1)原代髓核细胞生长良好,7 d后贴壁生长的细胞可达90%。(2)原代细胞凋亡率为(38.10±11.7)%,P2代凋亡率为(44.74±17.6)%,原代S期细胞( 7.88±2.1)%,P2 S期细胞( 2.76±0.7)%。[结论]传代后的髓核细胞凋亡率增高,S期细胞减少明显。

【关键词】  椎间盘; 髓核细胞; 细胞周期; 凋亡

 In vitro culture and cell cycle detection of the adult degenerated nucleus pulposus∥QIU Yun-feng,WU Xiao-tao,ZHAO Zi-ru ,et al. Department of Orthopaedics,Zhongda hospital of Southeast University, Nanjing 210009, China

    Abstract: [Objective]To establish an in vitro two-dimensional culture model of degenerated nucleus pulposus and detect samples’ cell cycle by flow cytometry to study why nucleus pulposus cells don’t grow well after passage. [Method]Nucleus pulposus tissues taken from protruded discs of 24 patients were treated by Trypsin and collagenase after surgical procedures,and then the cells were cultured in DMEM/F12 medium. Cell morphology was observed by an invert microscope and cell cycle of the primary and P2 cells were detected by flow cytometry after proliferation in monolayer culture.[Result]1.Primary culture cells of nucleus pulposus grew well in the medium, and 90% cells adhere to layer after about 7d .2.The rate of apoptosis of NP: primary (38.10±11.7)%,P2(44.74±17.6)%. The rate of S period : primary (7.88±2.1%), P2(2.76±0.7)%.[Conclusion]When going down to posterity the cells’ apoptosis rate grows while S period cells decrease.

    Key  words:intervertebral disc;  nucleus pulposus;  cell cycle;  apoptosis

    椎间盘退变是椎间盘突出症和慢性腰痛的主要原因之一,其具体机制尚不清楚。通过组织工程学的方法修复或复建退变椎间盘组织是目前国内外进行的一项热点研究工作,其中,种子细胞的体外扩增是首先要解决的问题。据文献报道髓核细胞的体外培养相对困难,本研究通过建立退变的成人椎间盘髓核细胞体外培养方法并测定其细胞周期,观测髓核细胞体外生长特性,为选择适宜的干预时机防止髓核细胞退变提供一定实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料和对象

    1.1.1  主要材料和试剂

    二氧化碳孵箱(德国Hereaus公司),DMEM/F12培养基(美国Sigma公司),胎牛血清、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(杭州四季清公司),其他试剂为国产分析纯产品。

    1.1.2  对象

    24例髓核组织标本分别取自因腰椎间盘突出症(16例脱垂型和8例突出型)而进行手术治疗的病人;L4、5椎间盘12个,L5S1椎间盘12个;病人年龄19~45岁,平均37.6岁。(x-±s D形式)

    1.2  培养与检测

    1.2.1  细胞培养

    取髓核摘除手术切除的标本,置入预先准备好的内含少量DMEM/F12培养液的无菌培养瓶并置入冰盒内迅速带回实验室。半小时内在超净台内剪碎消化培养,在无菌超净工作台中,将取出的髓核组织用PBS液冲洗3次去除血污,弃去纤维环,将胶冻样或软骨样髓核组织剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块。37℃下以0.25%(m/v)的胰蛋白酶消化20 min,每5 min,轻轻摇动1次。800 r/min离心5min,弃去上清液。36.5℃下用0.2%的Ⅱ型胶原酶静置消化4 h,至组织块逐渐消失。800 r/min离心5 min,去除上清液;用DMEM/F12培养液吹匀细胞,再次离心,重复3次。用计数板进行细胞计数,按1×106接种于底面积为25 cm2培养瓶中,加入5 ml含青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml和20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液。37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养。每2~3 d换液1次,每2 d用倒置相差显微镜进行观察、拍照。90%融合后用质量分数为0.25%的胰酶消化并按1∶2比例传代。

    1.2.2  流式细胞分析细胞周期

    对原代髓核细胞和P2髓核细胞用流式细胞分析仪检测细胞周期及凋亡率。各组收集1×106个细胞,PBS洗涤,(缓慢加入3 ml 70%冷乙醇,-20℃固定过夜) 。细胞检测前,PBS洗涤,加入碘化丙啶(PI)(sigma美国)1 ml避光孵育20 min。用流式细胞仪(美国Becton Dickinson,FACS Calibur型)测定细胞周期,ModFit软件分析细胞周期的分布和凋亡率。每组样本重复3次。

    1. 3  统计学方法

    将所得数据以均数±标准差(x-±s)表示,并±对数据进行t检验(表1)。

    2  结果

    2.1  倒置相差显微镜观察

    髓核内有三类细胞:脊索细胞胞体较小,呈多角形,或圆形,胞浆内含空泡,贴壁后伸出伪足;软骨或类软骨细胞,胞体较大,呈圆形或椭圆形;成纤维样细胞,贴壁后呈梭形。

    2.2  培养特性:

    原代培养的退变髓核细胞的贴壁时间较长,24 h后开始有少量细胞贴壁,3 d后半量换液,7 d后全量换液时可达90%贴壁(图1),甚至10 d后仍有少量细胞贴壁。15~20 d后髓核细胞开始进入对数生长期,增殖、融合非常活跃,光镜下可见多处细胞克隆,并分泌大量颗粒,有较多细胞开始融合。原代培养30 d达到90%融合可以传代(图2),传至第5 d(P5)后的细胞体积增大,呈现圆形,或不规则形,片状生长,细胞增殖几乎停滞,同时胞内空泡增多,出现明显衰老迹象(图3)。   图1贴壁后的髓核细胞呈多角形,圆形和梭形数量较少  图2传代前的原代髓核细胞  图3P3代的髓核细胞体积明显变大,生长变缓,形态不规则。(×200)倒置像差显微镜观察表1  原代及P2髓核细胞周期检测结果(n=24,x-±s)G0/G1SG2/M凋亡率原代(71.46±22.3)%( 7.88±2.1)%(20.59±5.9)%(38.10±11.7)%P2(71.01±19.7)%②( 2.76±0.7)% ①(26.23±7.2)%②(44.74±17.6)%①注:①与原代细胞比较P<0.01有显著性差异; ②与原代细胞比较P>0.053  讨论

    椎间盘退变引起的腰椎间盘突出症和慢性腰腿痛是骨科的常见病,其具体机制不详。临床上常采用手术切除突出椎间盘组织或行椎体间融合术等以缓解症状,但可引起继发的脊柱不稳或加速相邻椎间盘的退变。通过组织工程学的方法修复或逆转椎间盘组织退变是目前国内外进行的一项热点研究工作,并被认为是未来一种有希望的治疗选择。利用组织工程学的原理治疗椎间盘退变、突出,根据An[1]的观点可以分为三个阶段:早期利用生长因子恢复椎间盘细胞合成和改建细胞外基质的能力;中期利用携带生长因子的支架,或将生长因子转到细胞中来恢复和改建细胞外基质;晚期通过手术清除丧失功能的椎间盘细胞并植入利用组织工程学技术获得的工程化椎间盘(组织工程化髓核),其研究核心是种子细胞的培养和功能的研究。

    髓核细胞的体外培养相对困难,对培养的条件要求较高,培养时间较长。Helen等[2]认为即使给予较高的营养条件,椎间盘细胞生长也相当缓慢,细胞约需1个月时间才能从最初的组织块长至P1。Ichimura[3]等发现,髓核细胞的培养中最适宜pH值为7. 0。pH值降低可引起细胞代谢障碍,甚至导致细胞死亡,细胞内pH值降低也是细胞凋亡的一个重要特征。刘勇等[4]观察发现pH7.0~7.4之间髓核细胞生存活力未见明显差异性。Chiba[5]采用DMEM/F12对兔椎间盘组织块进行培养时发现,组织块形态良好,组织块内细胞代谢活跃。本实验采用DMEM/F12培养基加体积分数为0.20胎牛血清,培养基pH控制在pH7.0~7.4之间用于髓核细胞培养,细胞生长良好,并能增殖传代。人退变椎间盘细胞的贴壁时间为5~7 d 甚至更长,其稳定生长期较长,对数生长期短,细胞生长周期较长,说明退变的椎间盘细胞的生长活力低下。传代后髓核细胞生长相对较快,约30 d可以传1代,但当传至第2代时其细胞内空泡增多,分泌颗粒增多,细胞开始呈现衰老迹象。传到第5代后,细胞生长明显停滞。

    既往的研究[6]证明,在退变腰椎间盘中,髓核细胞凋亡率可高达(61.3±24.5)%,和本实验的结果相符。本实验中细胞经过1~2次传代后,髓核细胞体积明显变大,细胞周期测定显示71%细胞停滞在G0/G1期,传代对其影响不明显。张传志等[7]观察到即使在最佳营养条件下,体外培养髓核细胞经过多次传代后逐渐死亡,推测和细胞生长周期有关。作者发现体外培养的退变髓核细胞S期细胞较少,S期是细胞分裂的关键期,在此期间细胞的DNA含量通过复制而加倍,传到P2后该期细胞降低明显(P<0.01),而传代后髓核凋亡率升高(P<0.01)。这可能和S期细胞合成活跃对胞内外环境要求较高有关,外界环境(如胰酶的反复作用等)的变更作用诱使这类细胞发生凋亡。推测如果能针对这一特点加以干预,可能会使细胞增殖加速,而且最佳干预时期应在P1甚至原代。Takuji 等[8]发现周期性机械张力可促使髓核细胞增殖,主要表现在S期细胞的合成增加,髓核细胞的DNA合成增加。Gruber等[9]采集椎间盘细胞进行体外单层培养,并在培养液中加入不同浓度的IGF-1和PDGF,发现这两种生长因子均可降低椎间盘细胞的凋亡率,并且抑制效应与生长因子的浓度相关。Yamamoto等[10]将兔髓核细胞和间充质干细胞共同培养后发现,与间充质干细胞直接接触后髓核细胞增殖加快、活力上调。髓核细胞体外培养模型的建立和细胞周期的检测为进一步体外扩增髓核细胞提供了实验基础和依据。

    3  结论

    通过本次实验观察,笔者认为传代后髓核体外培养中有S期细胞减少,凋亡率高的现象,因此在培养过程中除了要注意培养液pH值、胎牛血清浓度等一般营养条件外,应着重注意防止在传代中诱导或加剧细胞凋亡的因素。例如传代时选用低浓度的胰酶,适当减少消化时间;从原代培养开始适当在培养液中添加IGF-1等抑制凋亡的生长因子也是很简便的方法。

【参考文献】
  [1] An HS,Thonar EJ,Masuda K.Biological repair of interverteral disc[J].Spine,2003,1:86-92.

[2] Gruber HE, Fisher EC Jr,Desai B,et al.Human ivtervertebral discs from the annulus:three-dimensional culture in agarose or alginate and responsiveness to TGF-β1[J].Exp Cell Res,1997,235:13-21.

[3] Ichimura K, Tsuji H , Matsui H ,et al.Cell culture of the intervertebral disc of rats ,factors influencing culture , proteoglycan,colleagen,and deoxyribonucleice acid synthesis[J].Spinal Disord,1991,4:428-436.

[4] 刘勇,胡有谷,陈晓亮.腰椎间盘细胞的培养及形态学观察[J].中华医学杂志,1999 ,79:101-109.

[5] Chiba K,Andersson GB,Masuda K,et al. A new culture system to study the metabolism of the intervertebral disc in vitro[J].Spine,1998,23:1821-1828.

[6] Kohyama K,Saura R,Doita M,et al.Intervertebral disc cells apoptosis by nitic oxide:biological understanding of intervertebral disc degeneration[J]. Med Sci,2000,46:283-295.

[7] 张传志,周跃,李长青.兔髓核细胞体外最佳培养营养条件的探索[J].中国矫形外科杂志,2005,13:1093-1094.

[8] Matsumoto T,Kawakami M,Kuribayashi K,et al.Cyclic mechanical stretch increases the growth rate and collagen synthesis of nucleus pulposus cell in vitro[J].Spine ,1999,24:315-319.

[9] Gruber HE, Norton HJ, Hanley EN Jr. Anti - apoptotic effects of IGF - 1 and PDGF on human intervertebral disc cells in vitro[J].Spine, 2000,25:2153 - 2157.

[10Yammamoto Y,Mochida J,Sakai D,et al.Upregulation of the vibility of nucleus pulposus cells by bone marrow-derived stromal cells[J].Spine, 2004,29:1508-1514.


作者单位:1.东南大学临床医学院,南京 ;2.东南大学附属中大医院骨科,南京


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