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牛胰蛋白酶抑制剂的研究进展*

来源:中华医学研究杂志 作者:王虹蛟1,王心童2,王强1△(综述),孟威宏3,颜炜群4( 2013-2-26

摘要: 【关键词】 蛋白酶抑制剂 蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)在蛋白质水解的调控中起重要作用。目前已发现100多种天然蛋白酶抑制剂。目前对丝氨酸蛋白酶抑制剂在其作用机制等方面都进行了系统的研究。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂结构和活性中心又将其分为Kunitz家族、Kazal家族、STI-Kunitz家族、hirudin及Serpins[1]。...


【关键词】  蛋白酶抑制剂

  蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)在蛋白质水解的调控中起重要作用。目前已发现100多种天然蛋白酶抑制剂。目前对丝氨酸蛋白酶抑制剂在其作用机制等方面都进行了系统的研究。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂结构和活性中心又将其分为Kunitz家族、Kazal家族、STI-Kunitz家族、hirudin及Serpins[1]。在丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz家族中,均有一段保守的Kunitz结构域(Kunitz domain),其中牛胰蛋白酶抑制剂(bovine pancreatic trypsin inhibitor,BPTI)是研究得比较清楚蛋白酶抑制剂。本文复习近年来有关BPTI研究进展的国内外文献做如下综述。

  1 BPTI的结构

  Kunitz 家族来源广泛,自然界的动、植物及微生物机体内都发现此类抑制剂的存在。Kunitz 家族的代表是BPTI,它是研究最早的Kunitz型蛋白酶抑制剂。Kunitz在1936从牛胰脏中纯化并结晶[2],发现具有抑制激肽释放酶和胰蛋白酶的功能。它由58个氨基酸残基组成,分子内六个半胱氨酸形成3对二硫键,其活性中心为Lys15-Ala16-Arg17(赖氨酸15-丙氨酸16-精氨酸17,KAR)。其中一对二硫键(Cys14-Cys38)位于分子表面,它使两段肽链(Cys32-Cys42,Cys9-Cys21)连接在一起,这一对二键被还原和重新氧化后不影响抑制剂活力。另外两对二硫键(Cys5-Cys55,Cys30- Cys51)位于分子内部,一旦还原后即失活[3]。整个分子呈梨形,由两条反平行的β-折叠,两段α-螺旋,β-转角和一些环组成[4]。它最主要的结构特征是含有两片180度扭曲的反平行β-折叠,这个折叠分别和β-转角与一对二硫键(Cys14-Cys38)相连,这个分子的主要片段1~14和38~58残基沿着β2折叠来回弯曲折叠,以使末端残基1和残基58能够在β转角处相互靠近,二硫键的共价连接也使这两端靠拢并和β-转角(30~51残基组成)靠近。N端的残基形成了一个短的螺旋段,C端形成了一个更长的、有规律的α-螺旋(残基48~56)[4]。分子的自然折叠和半胱氨酸以独特的方式共价连接使整个分子变的紧凑、稳定[5]。分子内部含有一个能容纳4个水分子的疏水核心,这个分子的活性位点在一个溶剂暴露的环区(loop)。它由15 个氨基酸残基组成,这个环和酶活性位点高度互补,其中关键活性残基P1位点与丝氨酸蛋白酶的S1特异性束缚“口袋”中的酶活性位点结合。X-晶体衍射的方法测定了β-胰蛋白酶和BPTI在P1位点的10种突变体形成的复合物的结构[6],抑制剂的专一性是由P1位置氨基酸残基的性质决定的,P1位置是Lys或Arg的抑制剂对胰蛋白酶有抑制作用。

  2BPTI的生物学功能

  BPTI对丝氨酸蛋白水解酶具有广谱的抑制作用,能通过形成可逆性的酶-抑制物复合体抑制如胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶、凝血酶及各种组织或血浆激肽释放酶等,每一复合物有特定的解离常数,解离常数越低,抑制其酶活性所需的BPTI浓度就低。(1)抑制中性粒细胞激活和脱颗粒具有抗炎作用:BPTI通过抑制人体多种以丝氨酸为活性中心的酶尤其是激肽释放酶、纤溶酶以及Ⅻ因子来抑制多路炎症反应途径[7]。可防止过氧化产物形成、内皮细胞损伤、保护脏器功能。(2) BPTI抑制循环中的纤溶酶,阻止血小板激活,保护糖蛋白受体及止血功能:能够抑制尿激酶型-纤溶酶原激活剂(u-PA)和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤溶酶原的激活[8],保护血小板功能。并且可以直接与纤溶酶结合,从而使纤溶酶失活,减少术后大出血。(3)抑制激肽释放酶的激肽形成和血管活性效应,防止缺血再灌注损伤。(4)减少补体激活,抑制C3a和C5a产生。(5)BPTI在pH 1.1和10.5时,以单体占优势,在中性pH时以二聚体占优势。对高温、酸、碱和酶都很稳定,在稀酸中加热至100℃,在2.5%三氯乙酸中加热至80℃都未见活性损失。(6)等电点偏碱性,pH在10~10.5之间。

  3BPTI的临床应用

  丝氨酸蛋白酶的正常作用受到破坏或与机体自身存在的抑制剂之间的平衡发生异常,均会引起机体组织的损伤,用BPTI可对这些损伤进行防治。在临床上BPTI广泛用于急性胰腺炎、手术后器官功能衰竭以及再灌注损伤、早产、肺气肿、脑水肿、肿瘤的浸润和转移等疾病治疗和预防。

  3.1应用于急性胰腺炎的治疗急性胰腺炎发病时,胰腺中的血清淀粉酶、溶酶体酶、组织蛋白酶B以及苹果酸脱氢酶的水平均会显著增高,溶酶体酶、组织蛋白酶B能激活胰蛋白酶原,从而激活许多其他的消化酶,导致多种蛋白酶在胰腺内的过度累积,引起胰腺本身的炎症及缺血性坏死等症状。炎性介质及毒素的进一步释放将导致全身的炎性反应综合征,严重时会出现多器官障碍。胰蛋白酶抑制剂可以抑制许多对导致急性胰腺炎起关键作用的酶,如胰蛋白酶、磷脂酶A、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等,并能抑制溶酶体酶,稳定溶酶体膜,从而起到对胰腺的保护作用。目前临床上应用的几种胰蛋白酶抑制剂类药物对急性胰腺炎均有显著疗效。

  3.2应用于心脏外科手术体外循环在心脏外科手术体外循环过程中机体处于一种非生理状态,同时伴有缺血、缺氧和各种酶、炎性介质、自由基的大量释放,体内很多丝氨酸蛋白酶释放也较多,而其抑制剂消耗较大,引起二者平衡的失调,导致凝血异常以及心脏、肺、肾等重要器官和血管的内皮损伤,并可引起术后出血、器官功能衰竭及再灌注损伤等。BPTI在心脏外科手术体外循环中既有抗凝血作用,又有止血作用:其抗凝血作用是因为它可以抑制舒血管素的活化,并可抑制激肽释放酶,间接抑制凝血因子Ⅻ的活化,阻断内源性凝血途径;其止血作用是由于它能抑制纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的激活因子,阻止纤维蛋白溶酶原的活化,同时可预防血小板损伤。另外BPTI还可通过降低纤维蛋白原的降解产物水平来减轻其对再灌注心肌的损害[9]。

  3.3应用于脑血管疾病的防治在临床上,脑水肿、脑缺血、蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛都是治疗的难题。有关BPTI的临床研究表明,BPTI有可能成为治疗上述疾病的新手段。防治脑水肿BPTI与类固醇激素具有相同程度的抑制脑血管通透性增高的作用,可明显地抑制脑含水量的增高[10],BPTI也可显著降低脑含水量及乳酸水平。其作用机制尚不明确,但基本认为是:(1)保护血脑屏障;(2)抑制溶酶体酶活化;(3)稳定细胞膜。另外,BPTI还可能通过阻止血液及脑组织中缓肽酶的生成,进而抑制花生四烯酸的释放,达到改善脑水肿的作用。防治脑缺血BPTI可防止因急性脑缺血所造成的ATP下降和脑水肿,减轻缺血时的代谢障碍,抑制血管活性物质的产生,从而改善缺血后再灌注时的充血情况。说明BPTI对脑缺血有保护作用。

  3.4应用于肺再灌注损伤的防治再灌注损伤在肺移植后期是个很严重的问题,再灌注过程中引起血管内皮细胞发生某些变化,激活沉积在夹紧的一侧肺上的中性粒细胞[11],活化的中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶,该酶能够使胶原蛋白分解,结果导致渗透性加速性肺水肿。BPTI对中性粒细胞弹性蛋白酶和中性粒细胞组织蛋白酶G有抑制作用,并可以稳定溶酶体膜,避免损伤的进一步发展。

  3.5其他方面的应用(1)骨科的应用:柯广珍报道,用静脉滴注BPTI代替控制性降压在髋关节置换术中止血。选择40例患者分为两组,结果止血效果相同,但静滴BPTI组避免了控制性降压平均动脉压下降、心率增快的副作用,表明BPTI法优于降压法。王震宇等用BPTI与透明质酸钠联合应用治疗骨性关节炎,也取得了良好的效果。(2)预防肠粘连 :曹天生等取成年雌鼠,开腹,按Galili法制成小肠与子宫左前壁粘连模型,关腹前分别于腹腔内置入2.0ml生理盐水,50000kIU BPTI 2.0ml,两周后,开腹观察粘连程度。生理盐水组粘连率为95%,抑肽酶组为45% ,表明抑肽酶抑制肠粘连有效。丁敏等的实验报道也证明了,BPTI抑制肠粘连有良好效果。(3)用于预防感染引起的早产:因感染引起的绒毛膜羊膜炎是迫切早产的主要发病机制之一,炎性介质浓度过高以及随之而产生的多形核中性粒细胞弹性酶(PMNE)在其中有重要的作用[12]。临床实验证明BPTI可以通过抑制相关的炎性介质,如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)以及白介素8(IL-8),并抑制PMNE以防止早产。(4)抑制肿瘤的浸润与转移:肿瘤的转移是肿瘤的恶性特征之一,是大多数实体瘤患者死亡的主要原因。基底膜是细胞外基质的一种,其破坏是肿瘤浸润转移的标志。肿瘤细胞对基底膜的浸润可分为3步:黏附、溶解和转移。其中溶解过程是由蛋白酶降解瘤细胞下方的基底膜。由此可见,蛋白溶解酶在瘤细胞浸润、转移中的作用必不可少,其中多种丝氨酸蛋白酶浓度与肿瘤的侵袭呈正相关。研究证明,人体内许多肿瘤细胞上都有蛋白酶抑制剂的受体[13],BPTI与受体的结合能够调节纤维蛋白酶的活性,抑制其对蛋白质的分解作用,阻断肿瘤细胞的浸润和转移过程,并重新修复细胞屏障。此外,BPTI还可用于治疗肺气肿、关节炎等,在胰岛的移植过程中还可抑制各种丝氨酸蛋白酶的活性,从而提高移植的成功率[14]。

【参考文献】
    1Bode W,Huber R.Natueal protein proteinase inhibitors and their interaction with protein- ases.Eur J Biochem,1992,204:433-451.

  2Kunitz M.Isolation of crystalline protein compound of trypsin and of soybean tryp sininhibitor. Physiol,1946,10(8):311-320.

  3Barbar E ,Hare M,Makokha M. NMR-detected order in core residues of denatured bovine pancreatic trypsin inhibitor.Biochemistry , 2001,40(32):9734-9742.

  4Czapinska H ,Otlewski J, Krzywda S. High resolution structure of bovine pancreatic trypsin inhibitor with altered binding loop sequence.J MOL Biol,2000,32(2):1237-1249.

  5Anruch W,Berndt KD ,Chavea M . The NMR solution structure of Kunitz-type proteinase inhibitors from the sea anemone Anemonia stichodactyle helianthus.Eur J biochem ,1993,212(19):675-684.

  6Hagihara Y,SHhiraki K,Nakamura T. Screening for stable mutants with amino acid pairs substituted for the disulfide bond between residues 14 and 38 of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) .J Biol Chem,2002,277 (52) :51043-51048.

  7Otlewski J, Jaskolski M, Buczek O, et al. Structure-function relationship of serine proteasepro- tein inhibitor interaction.Acta Biochim Pol ,2001,48(2):419-28.

  8Miler BE,Levy JH.The inflammatory response to cardiopulmomary bypass.Cardiothorac Vasc Anesth ,1997,11(3):355-360.

  9Kanayama N,Maehara K,She L.Urinary trypsin inhibitor sup-presses vascular smooth muscle contraction by inhibition of Ca2+ influx.Biochem Biophys Acta ,1998,1381(2):139-146.

  10Kamiya T,Katayama Y,Kashinagi F.The role of bradykinin in mediating ischemic brain edema in rats.Stroke,1993,24(4):571-576.

  11Tomohiro H,Yukio H.The effect of protease inhibitor on reperfusion injury after unilateral pulmonary ischemia.Transplantation,1998,55(2):254-258.

  12Kanayama N,Maradny E,Halim A.Urinary trypsin inhibitor supresses premature cervical ripening.Obster Gynecol Reprod Biol,1995,60(2):181-186.

  13Kobayashi K,Gotoh J,Hirashima Y.Inter-α-trypsin inhibitor bound to tumor cells is cleaved into the heavy chains and the l ight chain on the cell surface.J Biol Chem,1996,271(19):11362-11367.

  14Lu WT, Lakey JR, Juang JH, et al.Effect of trypsin inhibitor on islet isolation from fresh and cold preserved rat pancreas.Transplantation Proceedings,2003,35(1):488-489.


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