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黔产道地药材钩藤质量标准的研究*

来源:中华医学研究杂志 作者:王克英1,郭思妤2,祝晶3,姜洪旭3作者单位:1 550004 2013-2-26

摘要: 【摘要】 目的研究黔产钩藤药材的薄层色谱鉴别,采用RP-HPLC法测定了药材有效成分钩藤碱与异钩藤碱的含量,考察了方法的准确度和重复性。结果异钩藤碱和钩藤碱分别在0。异钩藤碱平均回收率(n=6)为98。钩藤碱平均回收率(n=6)为98。...


【摘要】  目的研究黔产钩藤药材的薄层色谱鉴别,采用RP-HPLC法测定了药材有效成分钩藤碱与异钩藤碱的含量,考察了方法的准确度和重复性。方法采用HPLC法:KromosilC18色谱柱( 250mm×4.6mm,5μm);流动相以甲醇-0.2%氨水溶液(65:35),流速:1.0ml/min,柱温:35℃ ;进样器温度:5℃ ;检测波长为245nm。结果异钩藤碱和钩藤碱分别在0.130 64~1.175 76μg(r=1.000 0 )和0.097 44~0.876 96μg (r=0.999 8)范围内呈良好的线性关系。异钩藤碱平均回收率(n=6)为98.88% ,RSD为0.38%;钩藤碱平均回收率(n=6)为98.28% ,RSD为0.72%。结论通过10批钩藤药材含量测定,结果表明该含量测定方法快速、简便、灵敏、准确、可靠,重复性好可为评价黔产钩藤药材的质量提供科学依据。

【关键词】  黔产钩藤;HPLC 钩藤碱;异钩藤碱;含量测定

  【Abstract】ObjectiveTo explore the optimal method of extraction and determination of rhynchophylline and isorhynchophylline from Guizhou uncaria.MethodsHPLC method, Chromatographic conditions: kromosil C18 column(250mm × 4.6mm,5μm)at 30℃. The mobile phase consisted of methanol-0.2% ammonia water solution(65:35)at the flow rate of 1.0ml/min. The automatic sample injector was set at 5℃ and the ultraviolet detector was operated at 245nm.ResultsA good linearity of isorhynchophyline was in the range of 0.130 64~1.175 76μg (r=1.000 0), the average recoveries were 98.88%, and the RSD were 0.38%; A good of rhynchophylline linearity was in the range of 0.097 44~0.876 96μg(r=0.999 8), the average recoveries were 98.28%, and the RSD were 0.72%.ConclusionThrough the determination of the ten different origin from Guizhou uncaria, the method is simple, fast and accurate, and it is the quality of the evaluation of the Guizhou uncaria provides scientific basis.

  【Key words】Guizhou uncaria; HPLC; Rhynchophylline; Isorhynchophylline; Determination

  黔产钩藤为茜草科茜草属钩藤的干燥带钩枝茎。钩藤是历版《中国药典)收载品种,也是贵州道地药材,具有清热平肝,熄风定惊的作用。主要用于头痛眩晕、感冒夹惊、惊痫抽搐、妊娠子痫以及高血压等症[1]。钩藤主要有效成分为生物碱,包括钩藤碱(Rhynchophylline)、异钩藤碱(Isorhynchophylline)、柯诺辛碱(Corynoxeine)、异柯诺辛碱(Isocorynoxeine)、柯楠因碱(Corynantheine)、二氢柯楠因碱等130多种[2,3]。现代研究表明,钩藤的主要有效成分是总生物碱,其中以钩藤碱与异钩藤碱为主,具有降血压、抗心律失常以及抗血小板聚集和抗血栓形成的作用[3~5]。目前评价钩藤质量优劣的标准,多以钩藤碱和异钩藤碱的含量为指标。因此,我们采用RP-HPLC法对黔产钩藤中的主要成分钩藤碱和异钩藤碱进行含量测定。来填补2010年版《中国药典》钩藤缺“薄层鉴别”、“含量测定”项的空白,为提高钩藤国家标准提供一定的科学技术依据。

  1仪器与试药

  高效液相色谱仪;美国WaTers2996 Separatnms Madule photodiode Arroy Detebo 高效液相自动进样及分离系统;Waters 2996二极管阵列;检测器紫外检测器 Empowrer色谱数据工作站;KQ-500D A型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),Mad in swizer land 电子天平(瑞士METTLER TOLEDO 公司);甲醇(色谱纯,美国Dikma公司);水(UPW-50N型超纯水纯水器)超纯水, 北京历元电子仪器技贸电子仪器公司双蒸水); 实验所使用的甲醇、乙醇、氯仿、氨水、三乙胺、冰醋酸、石油醚、丙酮等试剂试药均为分析纯。钩藤碱(纯度为98%)和异钩藤碱(纯度为96%)对照品购自上海原叶生物科技有限公司(批号2010923-2011)。所用钩藤药材均由贵州省昌昊中药发展有限公司提供(凯里、剑河、锦屏、荔波等)10个不同产地的10批样品。

  2薄层色谱鉴别

        取本品粉末 (过3号筛) 约1g,置三角烧瓶中,加甲醇低温超声3次(每次加30ml甲醇,超声30min),滤过,洗涤残渣及滤纸合并所有甲醇液,65℃水浴挥干,残渣用30ml水溶解,置分液漏斗中,氨水调节pH 8~10,氯仿振摇提取7次,每次20ml,合并氯仿液,65℃水浴挥干,残渣加甲醇1.0ml溶解,作为供试品溶液。取异钩藤碱和钩藤碱对照品加甲醇制成1ml各0.5mg的溶液作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各5μl,分别点于同一以硅胶G薄层板上,以三石油醚(60℃~90℃)-丙酮(6︰4)为展开剂,展开、取出、晾干、喷以改良碘化铋钾试液。在供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的红棕色斑点。见图1。

  3含量测定的方法与结果

  3.1检测波长的选择采用高效液相色谱法紫外检测器 Empowrer3D在200~400 nm波处长扫描了钩藤碱及异钩藤碱对照品和样品。结果从PDA图中可以看出对照品和样品紫外光谱扫描最大吸收一致,均在245nm处有最大吸收,故选择245 nm为测定波长。见PDA图2、图3。图2钩藤碱及异钩藤碱对照品3D PDA图图3黔产钩藤药材3D PDA图

  3.2色谱条件与系统适用性试验色谱柱十八烷基键和硅胶为填冲剂; KromosilC18柱(4.6mm×250mm,5μm), 以甲醇-0.2%氨水溶液(65:35)为流动相; 流速:1.0ml/min;柱温:35℃;进样器温度:5℃ ;检测波长为245nm。钩藤碱及异钩藤碱的检测波长均为245nm;理论塔板数按钩藤碱和异钩藤碱,峰面积计算应不低于3000;进样量10μl。

  3.3对照品溶液的制备精密称取钩藤碱和异钩藤碱对照品加甲醇制成每1ml含60μg和每1ml含80μg的混合溶液,即得。

  3.4供试品溶液的制备取本品粉末(过3号筛)约0.3g,精密称定,加入氯仿:甲醇(5:1)的混合溶剂20ml,冰箱5℃放置过夜,加0.5ml氨水,低温超声40min,过滤,用氯仿:甲醇(5:1)的混合溶剂洗涤容器及滤渣,滤液置蒸发皿中,在65℃水浴上挥干,残渣加甲醇定容置3ml容量瓶中,摇匀,微孔滤膜过滤,既得。

  3.5专属性试验精密吸取对照品溶液、样品溶液各10μl,在上述选定的色谱条件下进行测定,结果异钩藤碱的保留时间约在14.592min,钩藤碱的保留时间在23.065 min,两峰分离度良好,且黔产钩藤药材中的其他成分不干扰。见表1、表2,图4、图5。

  3.6耐用性试验主要考察3种不同厂家色谱柱对检测结果的影响,以此确认含量测定方法的耐用性。见表3、表4。表1系统适用性试验结果异钩藤碱表2系统适用性试验结果-钩藤碱   图4钩藤碱和异钩藤碱HPLC色谱图图5黔产钩藤药材HPLC色谱图表3不同色谱柱异钩藤碱含量测定结果表4不同色谱柱钩藤碱含量测定结果结果表明,不同厂家色谱柱测定结果良好,异藤碱含量和钩藤碱总含量的RSD为0.95%,耐用性重现性好。

  3.7线性关系考察精密称取钩藤碱和异钩藤碱对照品适量加甲醇制成0.056 46mg/ml的钩藤碱溶液和0.083 751mg/ml的异钩藤碱溶液。精密吸取上述混合对照品溶液2μl、6μl、10μl、14μl、18μl,按顺序进样,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积为纵坐标,异钩藤碱和钩藤碱为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程:异钩藤碱Y=2 042 275.693 9 X-1 710.228 1, r=1.0000 结果表明异钩藤碱在 0.130 64~1.17576μg进样量与峰面积的线性关系良好。见图6。钩藤碱Y=2 466 259.236 5X+13 438.500 0,r=0.999 8结果表明钩藤碱在 0.097 44~0.876 96μg进样量与峰面积的线性关系良好。见图7。图6钩藤碱线性标准曲线图图7钩藤碱线性标准曲线图

  3.8精密度实验精密吸取同一浓度的混合对照品溶液,重复进样6次,每次10μl,钩藤碱峰面积RSD为0.02%,精密度良好。异钩藤碱峰面积RSD为0.03%,密度良好。

  3.9稳定性实验取供试品溶液 ,按0、2、4、8、12、24h进样,每次进样10μl,异钩藤碱峰面积RSD为0.30%,钩藤碱峰面积RSD为0.31%,表明样品在24h内稳定。

  3.10重复性实验取榕江钩藤药材粉末(过3号筛)约0.3g精密称定,按样品测定方法,平行制备6份供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪测定,异钩藤碱含量平均值为0.06307%;RSD为0.31%。钩藤碱含量平均值为0.04345%;RSD为0.85%。重复性良好。

  3.11回收率考察实验采用加样回收法,精密称取已知异钩藤碱质量分数为0.6307mg/g, 钩藤碱质量分数为0.4345mg/g的样品6份,分别精密加入一定量的异钩藤碱和钩藤碱对照品溶液,按供试品溶液的制备方法制备,按上述色谱条件测定,在同样色谱条件下测定。异钩藤碱平均回收率为98.88%,RSD为0.38%;钩藤碱平均回收率为98.28%,RSD为0.72%。该方法回收率良好结果见表5、表6。表5黔产钩藤药材中异钩藤碱回收率表6黔产钩藤药材中钩藤碱回收率

  3.12样品测定分别精密吸取供试品溶液,与异钩藤碱和钩藤碱混合对照品溶液各 10μl,注入高效液相色谱仪中,按上述色谱条件测定,测定峰面积积分值,按外标法计算样品溶液中异钩藤碱和钩藤碱的总含量。 结果见表7。表7不同产地黔产钩藤药材中异钩藤碱和钩藤碱总含量

  4讨论

  4.1分析波长的选择经二极管阵列检测分析,钩藤碱和异钩藤碱分别均在244.4nm波长处有最大吸收,故选择在245nm波长处检测。

  4.2流动相的选择钩藤碱与异钩藤碱HPLC分离具有一定的难度,《中国药典》2010版一部钩藤项下没有其含量测定的记载,本研究在参照文献基础上,进行了多种流动相组成的尝试,其结果均不满意,如采用甲醇:水,不同比列0.01mol/L三乙胺水溶液,用冰醋酸调pH( 7.5)钩藤碱与异钩藤碱的保留时间极不稳定。通过摸索改用甲醇:0.2%氨水(65:35)分离效果良好,同时色谱柱更易清洗,能够最大限度上保护色谱柱。

  4.3钩藤碱与异钩藤碱为一对同分异构体,很不稳定,其标准溶液即使在避光冷藏保存的条件下,一周内两者均出现明显的分解现象,且两者存在相互转换的趋势,故建议钩藤碱与异钩藤碱标准品应冷冻干燥避光保存,实验时现配现用,尽快测定样品,以确保实验结果的真实可靠。另外,加热对两成分破坏性极大,本研究在水、醇、氯仿热回流条件下,钩藤碱含量仅为0.00095% ~0.009%;异钩藤碱含量仅为0.00071% ~0.0029%;故样品提取中我们采用了低温超声后置65℃水浴挥干。通过10批黔产钩藤测定,其结果稳定,重复性好,精密度高。表明该方法简便准确,可用于钩藤药材及其复方制剂中钩藤碱与异钩藤碱的质量控制,也为评价钩藤药材优劣提供了可靠的标准。

  (本文彩图见封三)

【参考文献】
   1国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版(一部).北京:化学工业出版社,2010:240.

  2郭星.HPLC法测定不同产地钩藤中异钩藤碱和钩藤碱的含量.河南中医,2010,30(1):40.

  3张荣.钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定.中药新药与临床药理,2009,20(4):338-341 .

  4仲崇林.反相高效液相色谱法测定植物钩藤中钩藤碱含量.应用化学,2006,23(9):1061-1062.

  5王英锋.高效液相色谱测定钩藤中钩藤碱异钩藤碱含量.药物分析杂志,l999,19(1):56-57.

  


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