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三拗芎葶合剂对低氧性肺动脉高压大鼠血清超氧化物歧化酶/丙二醛影响的实验研究

来源:《中华医学研究杂志》 作者:杨仁旭1,卢小龙2,杜建霖2Δ,常生杰2,任 颖2Δ, 2008-7-4
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摘要: 【摘要】 目的 观察三拗芎葶合剂对HPH大鼠功能形态学及血中SOD和 MDA的影响,并探讨其机制。方法 将50只雄性SD大鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、卡托普利组、三拗芎葶合剂中剂量组及三拗芎葶合剂大剂量组,每组10只。利用常压缺氧方法复制大鼠低氧性肺动脉高压模型,2周后灌胃相应药物,连续用药24天后,采用......


【摘要】  目的 观察三拗芎葶合剂对HPH大鼠功能形态学及血中SOD和 MDA的影响,并探讨其机制。方法 将50只雄性SD大鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、卡托普利组、三拗芎葶合剂中剂量组及三拗芎葶合剂大剂量组,每组10只。利用常压缺氧方法复制大鼠低氧性肺动脉高压模型,2周后灌胃相应药物,连续用药24天后,采用改良右心导管法测定肺血流动力学参数,比色法测定血清SOD水平与MDA含量;处死大鼠后,称量wW、RV和LV+S,计算右心肥厚指数(RV/LV+S)及肺渗出指数(wW/BW);利用图像分析方法,测定肺小动脉病理及其形态计量学。结果 (1)三拗芎葶合剂及卡托普利均能明显降低模型大鼠mPAP、wW/BW、RV/LV+S(P<0.05和P<0.01),改善模型大鼠血流动力学指标,部分逆转模型大鼠的肺血管重构;同时提高血清SOD活性水平,降低血清MDA含量(P<0.05和P<0.01),三拗芎葶合剂各剂量组与卡托普利组疗效相当;但治疗组上述各指标仍未完全恢复到正常对照组水平。结论 三拗芎葶合剂能提高血清SOD活性水平,降低血清MDA含量,能有效降低HPH模型大鼠的肺动脉高压,部分逆转肺血管结构重建,改善右心功能,其作用机制可能与清除自由基、抗脂质过氧化,保护EC,维持VSMC的正常舒张功能有关,提示该药将是防治HPH的有效中药复方制剂

【关键词】  三拗芎葶合剂;低氧性肺动脉高压;超氧化物歧化酶;丙二醛;肺血流动力学

    Experimental  research on the influence of Sanao Xiongting mixture on hypoxic pulmonary hypertension rats’ serum SOD/MDA
       
  YANG Ren-xu,LU Xiao-long,DU Jian-lin,et al.
  
  Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM   Chengdu,  Sichuan 610075,China
       
  【Abstract】  Objective  Observation the influence of Sanao Xiongting mixture on hypoxic pulmonary hypertension rats functional morphology and SOD/MDA in serum ,and discussing the mechanism. Methods   50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups : normal control group, model group, captopril group, Sanao Xiongting mixture of mid- dose group and Sanao Xiongting mixture of high-dose group, 10 in each group. Using hypoxia induce pulmonary hypertension, two weeks later gavage corresponding drugs, after 24 days of continuous medication,using modified right heart catheterization to determine the pulmonary hemodynamic parameters, colorimetry was used to determine the serum levels of SOD and MDA; Rats were killed and weighed wW, RV and LV + S, calculated the index of right ventricular hypertrophy (RV / LV + S) and pulmonary exudative index (wW / BW); Using image analysis method to determine the pulmonary arterial pathology and morphometry. Results   (1) Sanao Xiongting mixture and captopril both could significantly reduce the rats’mPAP, wW / BW, RV / LV + S (P< 0.05 and P<0.01), improve rats’ index of hemodynamics, partly reverse the pulmonary vascular remodeling; meanwhile, raising the level of activity of serum SOD, reducing the level of MDA (P< 0.05 and P<0.01), Sanao Xiongting mixture group and the captopril group were considerable, however, the above indexes of the treatment groups do not fully restored to the normal control group. Conclusion  Sanao Xiongting mixture can increase  the serum level of SOD activity and lower the level of MDA,can effectively reduce the HPH rats’ pulmonary hypertension, partly reverse the lung vascular remodeling, improving the right ventricular function, its mechanism may be related to eliminate the free radicals, anti-lipid peroxidation, protecting EC, maintaining VSMC’s normal diastolic function, suggesting that this drug will be a effective herbal medication in combating HPH.
   
  【Key words】  Sanao Xiongting mixture;  hypoxic pulmonary hypertension(HPH); SOD;  MDA;pulmonary hemodynamics
                                        
  肺动脉高压(pulmonary artery hypertension,PAH) 属于肺循环疾病中的一个重要类别。PAH由多种心、肺或肺血管本身疾病所引起,表现为肺循环的压力和阻力增加,可导致右心负荷增大,右心功能不全,肺血流减少,而引起一系列临床表现。目前广泛采用的PAH血流动力学定义为:静息状态下肺动脉平均压 >25mmHg,或运动状态下>30 mmHg。而相应的肺毛细血管嵌压<15mmHg。 PAH血流动力学分级,一般根据静息状态下肺动脉平均压分轻度:26~35mmHg;中度:36~45mmHg;重度:>45mmHg三级。依据PAH的分类命名(2003,威尼斯)和2007年6月ACCP肺动脉高压内科治疗指南, 其中与肺疾病和低氧血症相关的PAH有慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。所以低氧性肺动脉高压动物模型被广泛应用于研究该疾病的发生机制[1]。在COPD发生发展过程中,低氧作为导致PAH的重要因素,在初期表现为可逆的肺血管收缩,后期则表现为不可逆的肺动脉高压及伴有肺血管重建的病理状态。HPH则是COPD病理生理的关键环节,阐明其形成机制以及寻求理想的抑制HPH药物一直是COPD、肺心病防治的重要研究课题[2]。肺动脉高压属于中医“肺胀” 、“喘证”、“痰饮”范畴,其病机主要为:痰饮瘀血互结,肺失宣肃;治法宜为宣肺逐瘀化痰法;故拟用三拗芎葶合剂治疗COPD、HPH取得较好疗效, 在此基础上进行三拗芎葶合剂对HPH大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)/丙二醛(MDA)水平 、 肺血流动力学、肺血管重构的影响,初步探讨其作用机制。报告如下。
   
  1  材料与方法
   
  1.1  材料
   
  1.1.1  动物  健康成年雄性SD大鼠50只,体重192.3~237.8g,由四川省中医研究院实验动物中心提供[实验动物合格证号:scxk (111)2004-15]。
   
  1.1.2  药物  三拗芎葶合剂:由四川省中药材公司提供合格药材,经成都中医药大学附属医院药剂加工厂煎煮、回收挥发性成分、浓缩,制成浓度为100%的药液(每lml药液含生药1g)。卡托普利:安徽仁济制药有限公司,批号:20060412。
   
  1.1.3  主要试剂  MDA、SOD测定试剂盒:由南京建成生物工程研究所提供,批号:20040218。氮气:四川拓展特种气体有限责任公司提供。
   
  1.2  方法
   
  1.2.1  动物分组、大鼠HPH模型的建立[3.4]及给药方法  (1)50只SD大鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、三拗芎葶合剂中、大剂量组及卡托普利组,每组10只,分笼饲养,自由饮水、摄食。(2)正常对照组不做处理,其余4组造模2周后,在每天进入低氧箱前1h分别灌胃生理盐水、三拗芎葶合剂11 g/kg(相当于成人用量的10倍)、三拗芎葶合剂22g/kg(相当于成人用量的20倍)及0.1%卡托普利1mg/kg(相当于成人用量的20倍),各组所给药液体积相同,每日1次,连续给药至检查前24h停药。
   
  1.2.2  观察、检测项目及方法
   
  1.2.2.1  血流动力学指标  将大鼠以20%氨基甲酸乙酯 (1.6g/kg)腹腔麻醉后固定于手术台上,用一充盈肝素溶液的聚乙烯管(外径0.82mm)从分离的右颈外静脉经上腔静脉、右心房、右心室插管至肺动脉内,导管接压力换能器,通过Gould3400多导生理记录仪记录RVSP、RVDP、PASP、PADP、mPAP(纸速为5mm/s)。
   
  1.2.2.2  血清MDA含量、SOD活性水平测定  自大鼠股静脉处取混合静脉血2ml,采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性, 用巴比妥酸法(TBA法)测定MDA含量, 应用紫外线分光光度计,比色法记取吸光度值(OD值), 测定SOD活性水平及MDA含量。
   
  1.2.2.3  心肺组织重量  采血完毕后,立即开胸,自左心室壁剪口,从右室壁向肺动脉内注入生理盐水,灌洗肺内血液,分离肺脏,剪去肺门,以滤纸吸去表面水分,称量肺湿重(wW);取出心脏,去掉血管、心房,游离右心室(RV),剩下左心室及室间隔(LV+S),冰盐水洗净血液,以滤纸吸去水分,分别称量RV重和LV+S重,计算右心肥厚指数(RV/LV+S)及肺渗出指数(wW/BW)。
   
  1.2.2.4  肺组织病理形态学检查  取同侧肺组织(左侧)后,立即用10%福尔马林液固定1周,矢状切面右肺门水平各取组织2块,梯度酒精系列脱水,石蜡包埋,常规切片后行HE染色和弹力纤维染色,光学显微镜下观察肺小动脉形态学改变。拍照后以Mias-2000病理图像分析系统测量与终末细支气管伴行的肺小动脉(直径<300μm)管壁中膜厚度(MT)、外径(ED)、管壁面积(MA)、管腔面积(VA)、血管总面积(AA);然后分别计算管壁中膜厚度与血管外径比值(MT%)、管壁面积与血管总面积比值(MA%)和管腔面积与血管总面积比值(VA%),并计算出均值,作为大鼠的肺血管形态计量学指标进行统计分析。  
   
  1.2.2.5  统计学方法  采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析。数据用x±s表示,各组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采Student-Newman-Keulsg检验。P<0.05为差异有统计学意义。
   
  2  结果
   
  2.1  一般状况观察  模型组大鼠缺氧1周后,大鼠活动明显减少,倦卧,喘息,食量减少,毛发直立、杂乱,鼻部及唇周紫绀;三拗芎葶合剂组大鼠精神转好,毛发较前光整,呼吸渐趋平稳,活动增多。(注:模型组2只,三拗芎葶合剂中剂量组1只,卡托普利组1只大鼠经尸检证实发生与实验用药无关的意外死亡。)
   
  2.2  肺血流动力学指标变化  本研究采用改良右心导管法直接测定肺血流动力学指标,各组大鼠肺血流动力学状态对比见表1。                                                                                     
  表1  各组大鼠肺血流动力学状态对比 (略)
               
  三拗芎葶合剂中剂量组与卡托普利组值无明显差异(P>0.05);与模型组比较,三拗芎葶合剂各剂量组及卡托普利组的肺动脉压力皆显著降低(P<0.05和P<0.01),但各剂量治疗组与正常对照组相比,值仍较高,未达到正常组水平(P<0.05和P<0.01)。表明三拗芎葶合剂能降低模型大鼠的肺动脉高压。
   
  2.3  三拗芎葶合剂对血清MDA含量、SOD活性水平的影响  本次实验结果显示:与正常对照组相比,模型组大鼠血清SOD活性明显下降,MDA含量明显升高(P<0.01),而三拗芎葶合剂和卡托普利治疗组肺组织中MDA含量明显降低,SOD活性明显增强。其结果见表2。
   
  表2  各组大鼠血清SOD、MDA水平比较   (略)
           
  2.4  肺组织重量  与模型组比较,三拗芎葶合剂各剂量组wW和wW/BW均明显减轻 (P<0.05);三拗芎葶合剂各剂量组与卡托普利组比较无明显差异(P>0.05)。各治疗组与正常组相比,值仍较高(P<0.05)。其结果见表3。
    
  表3  各组大鼠wW、肺渗出指数比较  (略)
           
  2.5  心脏重量  与模型组比较,三拗芎葶合剂各剂量治疗组及卡托普利组均明显减轻,三拗芎葶合剂高剂量组与卡托普利组值相当(P>0.05);各剂量治疗组与正常组相比,值仍较高。其结果见表4。   

  表4  各组大鼠右心肥厚指数、RV/BW比较  (略)
           
  2.6  病理形态学的变化  各组大鼠肺小动脉MT、MT%;MA%、VA%测定,结果见表5。
   
  表5  各组大鼠肺小动脉MT、MT%、MA%、VA%测定结果  (略)

  光镜下,正常对照组大鼠肺小动脉管壁不增厚,内皮细胞扁平连续,细胞分布均匀,大小、厚薄较一致。模型组大鼠肺小动脉壁增厚,肺泡隔毛细血管扩张,间隔增宽,部分样本有灶性肺萎缩、偶见支气管炎。肺小动脉的中膜平滑肌明显增生肥大,管腔明显狭窄;肺血管损伤明显,内皮细胞变性肿胀,突向血管腔内。三拗芎葶合剂各剂量组与卡托普利组大鼠肺小动脉管壁增厚程度及管腔狭窄程度显著减轻,尤以卡托普利组效果明显。
   
  结果显示,模型组肺小动脉管壁增厚,管腔狭窄,三拗芎葶合剂和卡托普利在一定程度上可逆转肺血管形态重建,以卡托普利组效果更好。
   
  3  讨论
   
  低氧性肺动脉高压的临床表现及其发生、发展过程,当属中医“肺胀” 、“喘证” 、“痰饮”范畴。肺胀常继发于肺咳、哮病等之后,因肺气长期壅滞,肺恒久膨胀、不能敛降而胀廓充胸,以胸中胀闷,咳嗽咯痰,气短而喘为主要表现的肺系疾病。  历代中医著作对本病病因病机乃至立法选方用药均有较详细的论述。如《灵枢·经脉篇》曰:“肺手太阴之脉……,是动则病肺胀满,膨膨而喘咳”;《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证并治》曰:“上气喘而躁者,属肺胀”;“咳而上气,此为肺胀,其人喘,目如脱状,脉浮大者,越婢加半夏汤主之”;《医学入门》:“肺胀满,此痰与瘀血碍气,所以动则喘息”。因此,我们概括HPH的基本病机是:痰瘀互结、肺失宣降,痰、瘀是其关键病理产物。治法为宣肺逐瘀化痰。三拗芎葶合剂由麻黄、杏仁、葶苈子、川芎等组成,共奏宣肺利水、降气平喘、活血祛瘀之功。全方以通调肺气为核心,宣发以使“天气通于肺”,肃降以使“地气纳于肾”,充分体现了宣降肺气、通调水道,祛痰逐瘀的功效,切中病机,恢复肺之宣降功能。
   
  本实验的结果显示,三拗芎葶合剂能够有效改善模型大鼠的呼吸、活动、饮食、体重等整体情况;能明显降低模型大鼠的肺动脉高压,在一定程度上改善肺功能;提高SOD活性水平,降低MDA含量,其机理可能与清除自由基、抗脂质过氧化,保护EC;维持VSMC的正常舒张功能,部分逆转肺血管结构重建。   
   
  缺氧时肺血管内氧自由基产生增加,氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化物如MDA。MDA能损伤细胞膜,抑制Na+-K+-ATP酶,使Ca2+细胞内流增加,导致细胞内Ca2+超负荷,既可使支气管黏膜上皮细胞坏死,又可致肺血管及支气管平滑肌痉挛[5]。MDA是氧自由基导致的脂质过氧化代谢的最终产物,而SOD则是氧自由基的有效清除剂。此外,SOD是细胞保护因子。氧自由基在体内不断地产生和清除,在病理情况下,氧自由基产生增多,它与生物膜作用,使脂质过氧化物的产生增多,导致对血管内皮的损伤,增加肺血管的阻力,增强肺动脉的收缩反应[6],引起肺动脉高压,说明氧自由基在肺动脉高压形成中起一定的作用。
   
  本实验研究发现,慢性低氧大鼠肺组织中MDA含量明显升高,SOD活性明显降低,而三拗芎葶合剂和卡托普利治疗组肺组织中MDA含量明显降低,SOD活性明显增强。因此认为, 三拗芎葶合剂可降低氧自由基的产生,并有较强的清除氧自由基的作用,增加细胞对缺氧的耐受性,限制了氧自由基对肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞的损伤,阻抑肺血管收缩及肺血管结构重建。故认为三拗芎葶合剂对临床上由COPD等引起的肺动脉高压有较好的预防及治疗作用。三拗芎葶合剂还能部分逆转模型大鼠的右心室肥厚,其机制与改善肺血流动力学状态,以减低右心室的后负荷,改善右心功能有关。
   
  综上所述,本研究采用改良右心导管法,直观而准确地反映了三拗芎葶合剂对大鼠实验性肺心病形成过程中低氧性肺动脉高压的防治作用,为中药防治低氧性肺动脉高压提供了一定的理论和实验依据。

【参考文献】
    1 蒋明,钟小宁,柳广南,等.慢性支气管炎、肺气肿并肺动脉高压动物模型的研制.中国呼吸与危重监护杂志,2006,5(4):287-291.

  2 奚肇庆,蒋萌,居文政,等.复方薤白胶囊治疗慢性阻塞性肺病36例临床与实验研究. 中医杂志,2000,4(41):218-220.

  3 肖诗亮,高思海,杨辰垣. 常压缺氧性大鼠肺动脉高压模型的改进. 技术与方法,2001,17(4):190.

  4 郭胜祥,牛淑洁,翁心植,等. 一种简易实用的常压低氧舱系统. 中华结核和呼吸杂志,1996,19(4):252.

  5 冯青. 哮喘患者血清超氧化物歧化酶、丙二醛检测结果分析. 广西医科大学学报,1997,14(3):66-67.

  6 汤湘江,何德平,林琳.补气活血中药对肺原性心脏病的血液粘度、氧自由基和血浆NO的影响. 广州中医药大学学报,1999,12(6):289.


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