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耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB-3基因的发现

来源:中华医学研究杂志 作者:颜英俊糜祖煌刘华杨洋张凯杨明清黄文方 2006-8-19
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摘要: 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)是临床常见的条件致病菌,由于其固有和获得性耐药,使临床治疗成为一大难题。CARB基因编码产生羧苄西林酶,为β-内酰胺酶Bush分类中的2c,在我国CARB基因、流行基因亚型的研究未见报道。我们研究分析了2005年1~12月临床分离的34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa),发现了我......


  铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)是临床常见的条件致病菌,由于其固有和获得性耐药,使临床治疗成为一大难题。CARB基因编码产生羧苄西林酶,为β-内酰胺酶Bush分类中的2c,在我国CARB基因、流行基因亚型的研究未见报道。我们研究分析了2005年1~12月临床分离的34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa),发现了我院IMPRPa携带CARB-3基因,现总结报告如下。

  1  材料与方法

  1.1  菌株来源与质控菌株  34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于2005年1~12月我院住院病人的临床分离标本(包括:痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等),质控菌株包括:铜绿假单胞菌ATCC27853,大肠埃希菌ATCC25922。

  1.2  菌株鉴定及亚胺培南耐药菌株筛选  试验菌株经BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种,采用该仪器配套药敏试验复合板筛选亚胺培南耐药的Pa。

  1.3  主要仪器设备与试剂  Eppendorf centrifuge 5417R 低温离心机,恒温金属浴(杭州大和),MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research),Bio-RAD电泳仪,Bio-RAD 凝胶成像系统, 琼脂糖(OXOID),100bp DNA Ladder Marker(大连宝森),6×Loading buffer(北京天为时代)。

  1.4  模板DNA提取  采用蛋白酶K消化法。

  1.5  基因扩增  引物序列为:P1:5′-AAA GCA GAT CTT GTG ACC TATTC -3′,P2: 5′-TCA GCG CGA CTG TGA TGT ATA AAC -3′,扩增产物为588bp。热循环参数为:93℃预变性3min,93℃ 60s,55℃ 60s,72℃ 60s,最后一个72℃ 延伸5min,共循环35周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

  1.6  结果判断  取10μl扩增产物与2μl 6×上样缓冲液混匀,点样于1.5%琼脂糖凝胶,在100V电压电泳30min,出现588bp的条带即为CARB基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。

  1.7  序列分析  PCR产物经纯化后送上海生工生物工程公司进行DNA序列分析,测得序列在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST  中的BLASTn程序进行同源性和基因亚型分析。

  2  结果

  2.1  CARB基因PCR检测结果  34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌共检出11株CARB基因阳性株,检出率为32.4%,PCR扩增结果见图1。

  2.2  序列分析结果  任意抽取5株CARB基因阳性的PCR扩增产物进行单向测序,测得序列与GenBank中注册号为DQ309773的CARB-3基因完全同源(Identities=100%)。因此我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。

  图1  部分Pa菌株CARB基因PCR产物电泳图 (略)

  3  讨论

  CARB基因最早于1981年在Pa中发现[1],近年又从不动杆菌、弧菌属、奇异变形杆菌中检出,已发现CARB1-9型9个亚型[2~4]。我院IMPRPa的CARB基因携带率为32.4%,提示医务工作者应重视和加强Pa的防治和耐药监测。对CARB基因阳性菌株进行DNA序列分析,经同源性比较,结果显示:我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。IMPRPa中CARB基因检出、CARB-3基因亚型发现为国内首次报道。

  铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌,正常情况下不感染人体任何组织,但当人体免疫力下降或严重创伤或医疗操作后,Pa几乎可以感染人体的任何组织,临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染,常常危及患者生命。碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南)因其独特的抗菌优势,被临床广泛用于Pa引起的重症感染,导致临床分离株对亚胺培南耐药性增加。

  Pa对亚胺培南耐药的机制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和产酶等三种机制[5]。我们对IMPRPa的耐药机制的相关研究正在进行中。
  
  【参考文献】

  1  Paul G,Joly G ML,Bergogne BE,et al.Novel carbenicillin-lydrolyzing β-lactamases(CARB-5)from Acinetobacter calcoaceticus var.anitratus.FEMS Microbiol Lett,1989,50(1-2):45.

  2  Alejandro P,Roberto G M,Hector AS,et al.CARB-9 a carbenicillinase encoded in the VCR region of Vibrio cholerae Non-O1,Non-O139belongs to a family of cassette-encoded β-lactamases.Antimicrob Agents Chemother,2004,48(10):4042.

  3  Nucleotide sequence of the blaRTG-29CARB-5) gene and phylogeny of a new group of carbenicillinases.Antimicrob Agents Chemother,2000,44(4):1070.

  4  Bert F,Branger C,Lambert-zechovsky N.Comparative activity of beta-lactam agents (carbapenem excepted)against Pseudomonas aeruginosastrains with CARB or OXA beta-lactamASES.Chemotherapy,2004,50(1):31.

  5  Okamoto K,Gotoh N,Nishino T.Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics:penem resistance mechanisms and their interplay.Antimicrob Agents Chemother,2001,45(7):1964.

  作者单位:1 610072 四川成都,四川省医学科学院、四川省人民医院检验

       2 214026 江苏无锡,无锡市克隆遗传技术研究所
 
  (编辑:海  涛)

 


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