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Decorin因子对人胃癌细胞及其表达的MG7蛋白的作用

来源:中华医学研究杂志 作者:赵斌燕,齐峰 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 研究decorin因子对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用,以及对胃癌细胞特异表达的MG7蛋白的影响。方法 肿瘤细胞用含不同剂量(0、1、3、6μl)decorin的细胞培养液培养,应用MTT测定法来测定生长抑制率,电镜技术来观察细胞凋亡情况,免疫组化技术来检测细胞内MG7蛋白含量。结果 decorin对胃癌细胞具有生长抑制作......


  【摘要】  目的  研究decorin因子对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用,以及对胃癌细胞特异表达的MG7蛋白的影响。方法  肿瘤细胞用含不同剂量(0、1、3、6μl)decorin的细胞培养液培养,应用MTT测定法来测定生长抑制率,电镜技术来观察细胞凋亡情况,免疫组化技术来检测细胞内MG7蛋白含量。结果  decorin对胃癌细胞具有生长抑制作用,并呈现时间和剂量依赖性(方差分析,P<0.05)。电镜下可观察到凋亡细胞,免疫组化发现细胞内MG7的含量在处理前后有明显变化。结论  decorin因子抑制人类胃癌细胞生长,诱导其产生凋亡,有望作为一种新的凋亡诱导剂用于胃癌的治疗,并且该因子的作用与细胞内MG7含量有密切关系。

  【关键词】  decorin;胃癌细胞;MG7蛋白
   
  Influences of decorin on the BGC-823 cell and MG7 protein

  ZHAO Bin-yan,QI Feng.

  2003 Grade,Postgraduate Class,Qinghai Medical College,Xining 810001,China

  【Abstract】  Objective  To exp1ore the effect of decorin on the  BGC-823 cell and MG7 protein.Methods  The growth inhibition of cells induced by various concentrations of decorin in different time course was analyzed by using MTT assay. The cell’s apoptosis alterations were evaluated by transmission electron microscopy (TEM),and quantity of MG7 was evaluated by cytochemical staining.Results  The inhibition of proliferation on the cells was observed.The inhibitory effect was dose-dependent. Apoptotic cells were observed under transmission electron microscope. The different quantities of MG7 protein in cells were observed by cytochemical staining.Conclusion  Decorin inhibits proliferation,induces apoptosis of human gastric cancer cells,and the effects have close relation to the quantities of MG7 protein in cells.

  【Key words】  decorin;gastric cancer cells(BGC-823);MG7 protein

  Decorin是一种主要存在于结缔组织中与胶原纤维相关的蛋白多糖(proteoglycan,PG),有多种生物活性,可以调节和控制组织形态发生、细胞分化、运动、增殖及胶原纤维形成等过程,对防止组织和器官纤维化的发生有重要意义。已有研究表明,Decorin作为一种生物制剂可诱导肝癌细胞凋亡[1]。此外,大量资料表明,decorin能抑制多种组织来源的细胞生长[2]。MG7作为一种胃癌相关抗原由于其特异性最强,在胃癌组织中高表达[3~4],近年来逐渐受到大家的重视,也成为了既有效又经济的胃癌筛检的好方法。因此,我们选择人类胃癌细胞(BGC-823)来观察decorin对他们的生长抑制及促凋亡作用,以及对于胃癌细胞所表达的MG7的影响,从而为decorin抗肿瘤机制的进一步研究和胃癌的化学治疗或是化学辅助治疗的临床应用提供依据。

  1  材料与方法

  1.1  材料  胰酶、MTT购自北京夏斯生物技术有限公司,新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司,RPMI1640购自GIBCO,PBS 、ABC试剂盒购自博士德生物公司,胃癌细胞(BGC-823)由军事医学科学院惠赠。MG7抗体由第四军医大学提供。Decorin因子由山西医科大学微生物免疫实验室提供。

  1.2  方法

  1.2.1  细胞培养  BGC-823细胞置于含5%CO2 37℃的培养箱中培养,以含10%小牛血清的RPMI1640作为其培养基,于100ml培养瓶中进行培养,2~3d传代,用0.1%的PBS洗2遍,0.25%的胰酶消化,分装。

  1.2.2  细胞干预  将对数生长期的BGC-823细胞计数后,调整细胞密度为1×104/L,接种到96孔培养板,每孔200μl,每组5孔,细胞贴壁后每孔分别加入浓度为15μg/ml的decorin(1μl、3μl、6μl)继续培养24h、48h、72h,以培养液为对照组。MTT(5G/L)20μl,37℃再培养4h,弃上清加DMSO 200μl,震荡10min,于酶标仪490nm波长测定吸光度,记录数据。实验重复3次。肿瘤细胞的抑制率(%)=(1-实验组A值/阴性对照组A值)×100%。

  1.2.3  形态学观察  培养状态下,直接用倒置显微镜观察细胞的生长状况,形态改变及凋亡小体形成,细胞爬片培养经decorin作用后,0.1%PBS洗涤,95%乙醇固定,常规HE染色,观察细胞形态与核染色质的变化。

  1.2.4  MG7的测定  细胞培养同上,将生长旺盛的胃癌细胞用胰酶消化,制成密度为1×105/L的悬液,接种于24孔培养板中,孔内预置盖玻片,细胞贴壁后,分别加入5μl、15μl、30μl decorin,每孔设3复孔,以加常规培养液的孔做对照,分别培养24h、48h、72h,吸去上清液,95%乙醇固定15~20min,待免疫组化染色。收集上清液用于MG7的测定。

  1.3  统计学处理  用方差分析,q检验经SPSS统计分析软件进行数据的统计学处理,显著性取P<0.05。

  2  结果

  2.1  细胞增生抑制率  decorin因子能有效抑制体外培养的BGC-823细胞生长,其抑制率随时间延长和浓度升高而升高见表1,呈时间效应和剂量效应关系。

  表1  decorin因子对BGC-823细胞的生长抑制率剂量(略)  

  2.2  细胞HE染色形态观察  光镜下未处理组细胞形态呈多角形、圆形、细胞体积大,边缘不清,多形性明显,胞质较丰富饱满而透亮;核大小不一,可见核分裂、双核及核仁;细胞生长紧密甚至呈堆叠生长(图1A),decorin处理组细胞形态变化明显,由多角形为主变为形态一致、以梭形为主,胞质丰富透亮,可见部分圆形漂浮的细胞,其胞质内见许多颗粒;大部分细胞体积小,贴壁紧密,分散存在,细胞境界清楚;细胞核明显变小(图1B)。

  2.3  细胞化学染色观察  MG7阳性的细胞主要为细胞质和核膜着色,呈棕黄色细颗粒状,少部分细胞有细胞核和细胞质同时着色。处理前的肿瘤细胞,MG7的表达水平较高(图2A),而处理后,可以发现,MG7表达水平明显下降,并出现细胞形态的改变(图2B)。

  3  讨论

  凋亡异常在肿瘤发生发展中具有重要作用,逃避凋亡机制的调控在肿瘤细胞对常规化疗药物耐药中起关键作用。随着凋亡研究的深入,人们致力于开发新的药物以选择性诱导肿瘤细胞凋亡[5]。

  目前肿瘤仍是严重威胁人类生命的主要疾病之一,其发病机制复杂,影响因素多[6]。临床上,许多患者在确诊时已丧失了手术机会,而化疗和放疗的效果不佳、毒副作用较大。因此,如何早期发现肿瘤,同时寻找一种高效低毒的药物进行化疗或是辅助治疗晚期肿瘤,就是许多学者研究的方向。有研究表明decorin因子,在肝的纤维化和肾脏的病理变化中都起着重要的作用[7],越来越多的资料表明由于decorin在体内可以表现出多种生物活性因而能抑制多种细胞增殖,使转化的细胞和肿瘤细胞静止[8],这就为肿瘤治疗提供了新的药理学线索。Decorin作为一种小分子、富含亮氨酸的蛋白聚糖分子,在体内参与构成调控细胞增殖的负反馈环路。目前国外的研究表明,decorin对多种肿瘤细胞有抑制作用,其机制是decorin和细胞膜上的EGF受体结合,启动了MAP激酶/p21等的信号转导途径[9]。

  本实验中,我们通过MTT法发现decorin因子具有明显的抑制胃癌细胞生长的作用,并且存在量-效关系。通过电镜又观察到decorin因子对他们存在明显的促凋亡作用。通过细胞化学染色,我们发现decorin因子对胃癌细胞内的MG7蛋白具有明显的抑制作用,此蛋白的含量可能与decorin因子的作用密切相关。因此通过测病人血清中的MG7含量从而判定decorin因子对于胃癌患者的疗效可能成为一种简便易行的临床检验方法。

  (本文图片见封三)(略)

  【参考文献】

  1  赵素莲,王桂琴,田树华.Decorin对肝癌细胞株凋亡作用的研究.肿瘤防治杂志,2002,9(3):235-238.

  2  Santra M,Skorski T,Calabretta B,et al.De novo decorin gene expression suppresses the malignant phenotype in human colon cancer cells.Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(15):7016-7020.

  3  Meng FP,Ding J,Yu ZC,et al.Development and preliminary identification of the attenuated Salmonella typhimurium vaccine expressing the gastric cancer MG7-Ag mimotope.Xibao Yu Fenzi Mianyixue Zazhi,2002,18:138-143.

  4  Guo CC,Ding J,Yu ZC,et al.Development of oral DNA vaccine based on MG7-Ag mimotope of gastric cancer. Zhonghua Zhongliu Zazhi,2002,24:110-113.

  5  Kasibhatla S,Tseng B. Why target apoptosis in cancer treatment. Mol Cancer Theory,2003,2:573-580.

  6  Guo J,Shen ZX,Tan SY,et al.Expression of MDM2,P53 and P14ARF in human colon cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2002,10:540-543.

  7  Hogemann B,Edel G,Schwarz K,et al. Expression of biglycan,decorin and proteoglycan-100/CSF-1 in normal and  fibrotic human liver. Pathol Res  Practice,1997,193:747-751.

  8  Santra M,Skorski T,Calabretta B,et al.De novo decorin gene expression suppresses the malignant  phenotype in human colon cancer cells.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:7016-7020.

  9  Moscatello DK,Santra M,Mann DM.Decorin suppresses tumor cell growth by activating the epidermal growth factor receptor. J Clin Invest,1998,101(2):406-412.

  (编辑:守  中)

  作者单位:810001 青海西宁,青海医学院2003级研究生班

       030006 山西太原,武警山西总队医院骨二科


 


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