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毛细管区带电泳分离和检测利多卡因方法的研究

来源:中华医学研究杂志 作者:马汉祥刘红吕淞高改莉施伟忠李锋 2006-8-19
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摘要: 【摘要】 目的 建立毛细管电泳分离和检测利多卡因的方法。方法 毛细管区带电泳分离利多卡因,电泳分离条件:30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5。先采用压力(20psi)进水5s,随后电动进样(8kV,5s),检测波长200nm,运行电压30kV,温度20℃,运行时间5min。方法的检测限10ng/ml。...


    【摘要】  目的  建立毛细管电泳分离和检测利多卡因的方法。方法  毛细管区带电泳分离利多卡因,电泳分离条件:30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0)缓冲液。先采用压力(20psi)进水5s,随后电动进样(8kV,5s),检测波长200nm,运行电压30kV,温度20℃,运行时间5min。结果  在0.1~12.5μg/ml范围内呈良好的线性关系和重现性(R2=0.9998,n=5),回收率96.80%~105.8%,日内及日间精密度(RSD)均小于6%。方法的检测限10ng/ml。结论  本方法简便、快速、灵敏,为利多卡因的定量测定提供了新的、更为理想的方法学手段。

    【关键词】  毛细管区带电泳;分离;利多卡因
   
  Determination of lidocaine by capillary zone electrophoresis

  MA Han-xiang, LIU Hong, LV Song, et al.

  Department of Anesthesiology, the Affiliated Hospital of Ningxia Medical College, Yinchuan 750004, China

  【Abstract】  Objective  To establish capillary zone electrophoresis method for the determination and separation of lidocaine.Methods  Determination and separation of lidocaine by capillary zone electrophoresis (CZE) and electrophoresis conditions were as following: buffer was 30mmol/L NaH2PO4-H3PO4 solution (pH=5.0), the working voltage at 30kV, temperature at 20℃, UV detection at 200nm, sampling injected 5 seconds with voltage at 8kV.Results  The established method had a good linearity and precision within the concentration range of 0.1~12.5μg/ml(R2=0.9998). The range of recovery was 96.8%~105.8%, and relative standard deviations of inter-day and intra-day were less than 6%. The detection limit was 10ng/ml.Conclusion  This assay was simple, rapid and sensitive. It is a new and ideal analytical means for the determination of lidocaine.

  【Key words】  CZE; lidocaine; separation

    利多卡因属于酰胺类中效局麻药,具有起效快、弥散广、穿透性强、安全范围较大、无扩张血管作用及对组织无刺激等特点,可用于多种形式的局部麻醉,也是抗心律失常的常用药物之一。硬膜外阻滞用量为400mg,其血药浓度达2~4μg/ml。当血药浓度超过5μg/ml时出现中毒症状,超过7μg/ml时出现惊厥[1],因此其血药浓度监测具有重要的临床意义。以往多采用酶免疫分析法[2]、气相和高效液相色谱法[3]。但成本高,操作繁琐,干扰多,色谱柱易受污染等。而毛细管电泳(Capillary electrophoresis, CE)是20世纪90年代以来迅速发展起来的一种新型的分离检测手段,具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、运行成本低、预处理简单以及应用范围广等技术优势,已在生物医药领域获得了许多成功的应用[4]。本研究结合利多卡因的结构特点,选用毛细管区带电泳(CZE)分离模式,优化缓冲体系、pH值、检测波长、分离电压和温度等条件,建立了适合利多卡因定量测定的CZE方法。

  1  材料与方法

  1.1  仪器与试剂  毛细管电泳仪:美国Beckman公司P/ACE5000型配有紫外吸收(UV)、二极管阵列(PDA)和Beckman工作站;毛细管为涂层石英毛细管,57cm×75μm(河北永年光纤厂),有效长度50cm;PHS-3B精密pH计(上海精密科学仪器有限公司);SB2200T超声波洗涤装置(必能超声上海有限公司)。
    利多卡因(针剂,0.1g/5ml,山东兖州益健制药有限公司批号:0407182);利多卡因标准品(宁夏医学院附属医院制剂中心 批号:030408)。NaH2PO4、H3PO4 、HCI和NaOH等试剂均为国产分析纯,水为自制双蒸去离子水。

  1.2  样品溶液和缓冲液的制备

  1.2.1  标准品及样品溶液的配制  准确称取利多卡因标准品10mg,用双蒸去离子水溶解至100ml。分别配制浓度为12.5、6.25、2.5、0.5和0.1μg/ml标准溶液,用双蒸去离子配制不同浓度的利多卡因样品。用0.45μm微孔过滤器过滤,超声波脱气5min后备用。

  1.2.2  运行缓冲液的配制  精密称取NaH2PO4适量,加水制成15~40mmol/L NaH2PO4。用H3PO4和NaOH将其pH值分别调为4.4、4.6、4.8、5.0和5.2低温贮备。

  1.3  实验条件的选择  开机后,以1mol/L HCI、0.1mol/L NaOH溶液、水及NaH2PO4-H3PO4缓冲液冲洗毛细管各3min,两次进样之间以0.1mol/L NaOH溶液、水及缓冲液冲洗毛细管3min后进样:先采用压力(20psi)进水5s,随后电动进样(8kV,5s),运行时间5min。以迁移时间、峰高、峰面积的重现性和峰形的对称性作为分离效果的判断依据,综合上述参数优化实验条件。

  1.3.1  缓冲体系  根据利多卡因的理化性质及缓冲液的选择原则,选择NaH2PO4-H3PO4为实验的缓冲体系。再以1.2.2项配制的缓冲液选择最佳运行缓冲液浓度和pH值。

  1.3.2  检测波长及进样条件  根据利多卡因的理化性质,以PDA检测器进行扫描。在200nm有较大吸收峰。因此,确定采用200nm作为UV检测波长;先采用压力(20psi)进水5s,随后电动(8kV,5s)进样。

  1.3.3  分离电压和温度  分别采用15、18、20、23、25、28及30kV作为分离电压,选择最佳分离电压;分别在柱温为15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、28℃及30℃,选择最佳柱温。

  1.4  重现性和最低检测限  为确定上述分析条件下定量分析的精密度,考察利多卡因的相对迁移时间和校正峰面积的重现性。重复8次进样,计算迁移时间的相对标准差(RSD)和校正峰面积的RSD。当电泳峰高与噪声比值(S/N)为3时, 计算利多卡因的最低检测限。

  1.5  回收率和精密度  以12.5、2.5、0.5μg /ml高中低3种浓度的利多卡因分别进行CZE分析,以校正峰面积计算得出的利多卡因浓度与加入的利多卡因量之比计算回收率;同法,1d内平行测定5次,测得日内精密度;连续5d,每日测定高中低3种浓度各1次,测得日间精密度。

  2  实验结果

  2.1  在所选择的实验条件下,利多卡因获得满意的分离。以药物浓度为横坐标(C),校正峰面积为纵坐标(A)进行线形回归。在0.1~12.5μg /ml范围内线形关系良好:C=0.0004193×A+0.0627, R2=0.9998。优化条件下的利多卡因(12.5μg/ml)CZE图谱见图1。

  图1  利多卡因区带电泳图谱 略

  2.2  实验条件的选择  30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0)为最佳缓冲液,见表1,表2。

  表1  不同浓度的缓冲液对利多卡因分离度的影响 略
 
  表2  pH对利多卡因分离度的影响 略

  最佳检测波长200nm、运行电压30kV、实验温度20℃。见表3,表4。

  表3  工作电压对利多卡因分离度的影响 略

  表4  柱温对利多卡因分离度的影响 略

  2.3  回收率和精密度  平均回收率为96.8%~105.8%;日内、日间RSD小于6%。见表5。

  表5  加样回收率和精密度测定结果 略

  2.4  重现性和最低检测限  相对迁移时间的RSD小于4%,相对校正峰面积RSD小于6%。利多卡因的最低检测限为10ng/ml。

  3  讨论

  本研究主要探讨毛细管电泳条件的选择和优化。毛细管区带电泳法中,不同的缓冲体系、缓冲液pH值、温度、电压、检测波长以及进样方式都会影响样品的保留时间、吸收度、重复性和峰形[5,6]。

  缓冲体系不合适,分离效果会很差,甚至导致分离失败。缓冲液的pH直接影响待分离样品表面的电荷量及毛细管表面的电荷密度[5]。本研究结果显示30mmol/L NaH2PO4-H3PO4缓冲体系在pH=5.0为最佳。电压是影响径向电场的主要因素之一,可以改变样品的分离效率和速度。采用高电压,将使分离时间大大缩短,从理论上讲将提高分辨率[6]。但电压太高将使电泳过程中产生的焦耳热无法及时散发,引起分辨率降低,峰形变宽等现象。电压太低,分离时间会延长并且会影响分离效果。本实验结果提示在28kV和30kV时,峰形和吸收度无差别,但30kV时,分离时间较短。温度的改变将影响电极缓冲液的粘度,当温度升高时,粘度降低,从而使电流升高,电渗流增大,分离时间缩短。但温度太高,会使毛细管中产生的焦耳热难以及时散发,引起峰形变宽,影响分离效果。温度过低会使分离时间延长,本实验结果20℃最佳。

  本实验毛细管区带电泳分离利多卡因的优化条件为:缓冲液为30mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH=5.0);先采用压力(20psi)进水5s,随后电动进样(8kV, 5s);检测波长200nm;运行电压30kV;柱温20℃。本研究应用毛细管区带电泳法分离并定量分析利多卡因,为临床开展利多卡因血药浓度监测奠定了基础。

  【参考文献】

  1  庄心良,曾因明,陈伯鉴.现代麻醉学.第三版.北京:人民卫生出版社,2003,951-960.

  2  Pape BE, Whiting R, Parker KM, et al. Enzyme immunoassay and gas-liquid chromatography compared for determination of lidocaine in serum. Clin Chem,1978, 24:2020-2022.

  3  Swezey CB, Ponzo JL. Liquid chromatographic determination of lidocaine in serum. Clin Biochem,1984,17:230-232.

  4  王义明,罗国安,魏伟,等.毛细管电泳在医药领域中的应用.色谱,1997,15:494-498.

  5  罗国安,王义明.毛细管电泳的原理及应用.色谱,1995,13:437-407.

  6  谢莹,林梅,张正行,等.提高毛细管电泳重现性的几种方法.药学进展,1999,23:261-264.

  作者单位: 750004 宁夏银川,宁夏医学院附属医院麻醉科

  (编辑:文  静)


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