当前位置:首页 > 合作平台 > 在线期刊 > 中华医学研究杂志 > 2005年第5卷第4期 > 论著 > 粘附分子E-selectin在急性胰腺炎大鼠肺组织中的表达

粘附分子E-selectin在急性胰腺炎大鼠肺组织中的表达

来源:INTERNET 作者:林栋栋 孙家邦 李非等 2005-7-27
336*280 ads

摘要: 【摘要】 目的 探讨粘附分子E-selectin在大鼠急性胰腺炎肺损伤中的作用。 方法 大鼠胰胆管逆行注射3。5%牛磺胆酸钠,制作大鼠重症急性胰腺炎并发肺损伤模型。将实验大鼠分为正常对照组、胰腺炎1、4、8、12、24h组。...


    【摘要】 目的  探讨粘附分子E-selectin在大鼠急性胰腺炎肺损伤中的作用。 方法  大鼠胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠,制作大鼠重症急性胰腺炎并发肺损伤模型。将实验大鼠分为正常对照组、胰腺炎1、4、8、12、24h组。分别对胰腺损伤、肺损伤程度进行病理评分,酶显色法测定血清脂肪酶水平,并测定肺组织湿/干重比;逆转录聚合酶链反应技术检测各组大鼠肺组织E-selectin的表达。 结果  造模后1h,大鼠即出现较明显的胰腺损伤,伴有血清脂肪酶升高,随着时间的延长,胰腺损伤逐渐加重,以12h为重。造模后1h,肺损伤评分即有升高,但肺组织湿/干比无明显变化,此后,肺损伤程度逐渐增加,以24h为重,光镜下主要表现为肺组织炎性细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡腔内渗出液、肺泡腔塌陷等。正常大鼠肺组织内E-selectin mRNA呈低水平表达,造模1h后,大鼠肺组织内E-selectin mRNA表达明显增加,至12h达最高水平;大鼠肺组织内E-selectin mRNA表达与胰腺损伤程度、肺损伤程度成正相关。 结论  大鼠肺组织内E-selectin参与了胰腺炎肺损伤的过程,抑制肺组织内中性粒细胞的粘附可能是治疗胰腺炎肺损伤的新途径。
      
  关键词  急性胰腺炎 动物模型 肺损伤 粘附分子
    
  The expression of adhesion molecule E-selectin in lung tissue of rats with acute pancreatitis 
  Lin Dongdong,Sun Jiabang,Li Fei,et al.
   
  Department of General Surgery,Xuanwu Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing100053.
   
  【Abstract】 Objective To explore the role of E-selectin in pathogenesis of acute pancreatitis associated a-cute lung injury(PALI)in rats.Methods Pancreatitis was induced with3.5%sodium taurocholate by method of Aho et al.Animals were sacrificed at1,4,8,12,and24hours after induction of pancreatitis.The severity of pancreatitis was evaluated by quantitating serum lipase and pancreatic pathologic score.Lung injury was evaluated by lung patho-logic score and lung water content.RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)analysis was per-formed to assess gene expression of E-selectin in lung tissue.Results Lung injury can be found at1hour after in-duction of pancreatitis with3.5%sodium taurocholate.The microscopic findings of lung injury included leukocytes infiltration in lung tissue,pulmonary sepatal thickening,pneunoedema and collapse of alveolar cavity.Lung water content increased from4hours after induction of pancreatitis.The expression of E-selectin mRNA in lung tissue in-creased markedly1hour after induction of pancreatitis,and gradually reached its peak after12hours.Conclusion E-selectin may be involved in the pathogenesis of PALI.Inhibition of leukocytes adhesion in lung tissue may be a new way for treatment of PALI.
   
  Key words acute pancreatitis animal model aute lung injury adhesion molecule
      
  急性胰腺炎(AP)是临床上常见的急腹症之一。重症急性胰腺炎患者病死率高,达20%左右。其中急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或其严重形式急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是SAP患者早期死亡的主要原因 [1,2] 。因此,有必要进一步深入研究AP并发ALI的发病机制,以找到针对性强的确切有效的治疗措施。目前研究表明,多种因素参与了胰腺炎肺损伤的病理过程,其中包括:肺泡表面活性物质、游离脂肪酸、胰酶、细胞因子、粘附分子、一氧化氮、补体、血小板活化因子、活性氧、蛋白水解酶等 [1] 。本研究的目的在于探讨粘附分子E-选择素(E-selectin)在大鼠胰腺炎肺损伤中的作用。

  1 材料与方法
   
  1.1 动物分组及材料 雄性Wistar大鼠43只(购自首都医科大学实验动物中心),体重250~300g;随机分为正常对照组(6只)、胰腺炎不同时点组(胰腺炎1、4、8、12、24h组分别为7、7、7、7、9只)。牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司;总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Promega公司;SP-100型微量注射泵购自日本JMS公司;冷冻台式离心机5804R型购自德国Eppendorf公司;PTC-200DNA仪购自美国MJ Research公司;紫外分光光度计DU-600购自美国Bechman公司;凝胶图像扫描仪购自英国EEC公司。
   
  1.2 急性胰腺炎模型的制备 大鼠实验前14h开始禁食,自由饮水。参照Aho [3] 等的方法制备急性坏死性胰腺炎模型。10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔内注射麻醉,上腹正中切口进入腹腔,显露胰胆管,以血管夹阻断近肝门处胰胆管后,用4号头皮静脉针于十二指肠乳头附近经十二指肠壁穿刺,逆行插入胰胆管,在十二指肠乳头处用手指捏闭胆总管末端。将3.5%牛磺胆酸钠(购自美国Sigma公司)溶液用微量注射泵恒速(18ml/h)注入胰胆管,剂量为1ml/kg。造模后,所有大鼠均皮下注射生理盐水5ml,以补充血容量不足。
   
  1.3 取材方法 实验结束后,将大鼠剖腹,肉眼观察胰腺炎症轻重情况。下腔静脉穿刺取血,静置2h后,以3800r/min离心3min,取血清-20℃冻存,用于测血清脂肪酶。取胰头固定位置胰腺组织,10%甲醛固定,制成石蜡切片,用于HE染色。开胸,取左肺下叶,10%甲醛固定,制成石蜡切片,用于HE染色;取右肺下叶,迅速投入液氮冻存,用于RT-PCR;取右肺上叶,称湿重后,锡箔纸包裹,-20℃冻存,用于计算肺组织的湿/干重比。
   
  1.4 血清脂肪酶测定 以全自动生化分析仪采用酶显色法测定大鼠血清脂肪酶。
   
  1.5 病理学检查 采用盲法,由病理科医生在光镜下观察胰腺及肺组织学改变。(1)胰腺损伤组织学评分:以改良Schmidt [4] 法,并参照Pozsar [5] 的方法对胰腺损伤进行评分。(2)肺损伤组织学评分:参照Hofbauer [6] 等的方法,根据肺实质组织和空肺泡所占面积的百分比判断肺损伤的程度。

  1.6 肺组织湿/干重比 肺组织湿/干重比 [7] :将已称重的大鼠肺组织放入烤箱内,160℃烘烤48h,再称重,计算肺组织的湿/干重比。
   
  1.7 肺组织RNA提取及RT-PCR E-selectin、β-actin引物根据文献,并在GenBank进行核对后,由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下:E-selectin(507bp):正义链CAACGTGCACGTTTGACTGT 反 义 链 AGGTCAAG-GCTTGAACACTG;β-actin(302bp):正义链GAGGCCCAGAG-CAAG AGAGG反义链TCACCGGAGTCCATCACGAT。
   
  从液氮中取出肺组织标本(100mg),提取总RNA,-80℃冻存;检测RNA质量后,合成cDNA第一链,-20℃保存;集中进行PCR扩增,反应条件:95℃预变性5min,然后按94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,扩增35个循环,最后72℃延伸7min。PCR结束后,扩增产物置于-20℃保存。PCR产物的定量:将PCR产物6μl与Nuclease-free water4μl、loading fuffer2μl混匀后,加入1.2%琼脂糖凝胶上样孔中,用1×TAE(50×TAE:242g tris,57.1ml冰醋酸,100ml0.5mol/L EDTA,加水至100ml)电泳液在75V电压下电泳;电泳40min后,在紫外透视仪下观察琼脂糖凝胶,并照相;然后用凝胶图像扫描仪测算每条带的光密度值,用E-se- lectin扩增产物带之光密度值与β-actin扩增产物带之光密度值的比值表示每个样本E-selectin的表达水平。
   
  1.8 统计学处理 实验结果以均数±标准差(ˉx±s)表示,采用SPSS11.0统计软件进行分析。首先进行方差齐性检验,然后进行单因素方差分析;相关分析采用线性相关分析。
    
  2 结果
   
  2.1 胰腺炎大鼠胰腺及肺组织病理变化
   
  2.1.1 胰腺病理变化 胰胆管逆行注入3.5%牛磺胆酸钠后,胰管周围胰腺组织颜色立即变红,并逐渐扩展、加深。造模1h后再次剖腹发现胰腺颜色变暗,明显水肿,未见明显坏死及出血。造模8h后剖腹,腹腔内可见血性腹水,肠管淤胀,胰腺与周围组织轻度有粘连,胰腺水肿加重,色泽更差,胰腺及网膜组织多处皂化斑。造模24h后,大鼠腹胀明显,剖腹后可见腹腔内大量血性腹水,肠管淤张,胰腺与周围脏器粘连严重,表面呈灰褐色并可见坏死灶及皂化斑。光镜下观察:造模后1h即可见胰腺小叶间隙增宽及少量炎细胞浸润;此后,随着时间的延长,胰腺损伤逐渐加重,12h时胰腺损伤已经十分显著,表现为胰腺组织水肿、出血及片状坏死,大量炎细胞浸润、部分腺叶正常结构消失。造模24h组死亡2只,病死率为22.22%。胰腺损伤病理评分显示:造模后1、4、8、12、24h胰腺损伤病理评分与正常对照组比较差异有显著性;造模后1、4、8、12h,胰腺损伤病理评分逐渐升高,而且各组之间差异有显著性;造模后12、24h胰腺损伤病理评分比较,差异无显著性(表1)。
   
  2.1.2 肺组织病理改变 正常对照组大鼠肺组织肉眼及光镜下均未见明显病变。造模1h后,大鼠肺组织可见轻度损伤,主要表现为肺泡间隔增宽、炎细胞浸润;造模8h后,大鼠肺组织损伤明显加重,部分大鼠出现胸水,光镜下可见肺泡间隔更宽,炎性细胞浸润增加,肺泡腔内出现渗出液,部分肺泡腔塌陷。12h及24h大鼠肺组织损伤更加严重,可见出血、实变。
   
  肺损伤病理评分显示:造模后1、4、8、12、24h肺损伤与正常对照组比较差异有显著性(P<0.05);随着时间的延长,肺损伤病理评分逐渐升高,但是其升高幅度小于胰腺损伤病理评分升高幅度;造模8h后各组肺损伤程度与1h组比较差异有显著性(表1);造模8h后各组肺损伤程度比较差异无显著性。
    
  表1 大鼠胰腺及肺组织损伤、肺组织湿/干重比、血清脂肪酶 (略)
    
  注:与对照组比较 * P<0.05;与1h组比较 # P<0.05

  2.2 胰腺炎大鼠血清脂肪酶的变化 造模1h后,即可见胰腺炎大鼠血清脂肪酶较正常对照组明显升高;此后,随着时间的延长,胰腺炎大鼠血清脂肪酶逐渐升高,至12h达到最高值;但是,4、8、12h组比较,大鼠血清脂肪酶差异无显著性;24h组大鼠血清脂肪酶水平较12h时略有下降,但是两者之间差异无显著性(表1)。
   
  2.3 胰腺炎大鼠肺组织湿/干重比变化 造模后,随着时间的延长,大鼠肺组织湿/干重比逐渐升高;造模4h后各组与正常对照组比较,差异有显著性;造模8h后各组与1h组比较差异有显著性;造模24h大鼠肺组织湿/干重比达到最高值;造模8、12、24h各组肺组织湿/干重比差异无显著性(表1)。
   
  2.4 RT-PCR检测胰腺炎大鼠肺组织E-selectin mRNA表达的变化 正常对照组大鼠肺组织内E-selectin mRNA为低表达(0.17±0.06);造模1h后,大鼠肺组织内E-se-lectin mRNA表达略有增强(0.18±0.02),但与正常对照组比较,两者之间差异无显著性;随着时间的延长,大鼠肺组织内E-selectin mRNA表达明显增强,至12h组达到最高水平;造模4h组(0.54±0.11)、8h组(1.13±0.12)、12h组(1.14±0.10)与正常对照组、1h组比较,差异有显著性;造模8h组、12h组之间比较,差异无显著性;造模24h组,大鼠肺组织内E-selectin mRNA表达(0.82±0.20)较前明显减少,与8h组、12h组比较差异有显著性,但其表达水平仍高于正常对照组及造模1h组(表2、图1、2)。

  (图1、2见附页1)(略)
    
  表2 胰腺炎大鼠肺组织内E-selectin mRNA的表达动态变化 (略)
    
  注:与对照组比较 * P<0.05;与1h组比较 # P<0.05;与12h组比较 △ P<0.05
    
  2.5 相关性分析 采用线性相关分析发现,胰腺炎大鼠肺损伤程度、肺组织内E-selectin mRNA表达与胰腺损伤程度存在正相关关系,其相关系数分别为0.857、0.725;胰腺炎大鼠肺损伤程度与肺组织内CINC mRNA表达存在正相关关系,其相关系数为0.795。
    
  3 讨论
    
  E-选择素又称内皮细胞白细胞粘附分子-1(endothe-lial leukocyte adhesion molecule-1,ELAM-1)、CD62E,是一种重要的粘附分子,属于选择素家族。其最早发现于1985年,1989年,其基因被克隆 [8] 。E-选择素的分子量为115kD,其表达主要局限于活化的血管内皮细胞;其靶细胞为中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞 [9] 。E-选择素与细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)组成了内皮细胞上最重要的3种粘附分子,在白细胞与内皮细胞粘附的不同阶段发挥各自不可替代的作用,共同介导了白细胞与内皮细胞粘附 [10] 。
   
  内皮细胞受TNF-α、IL-1刺激后可合成E-选择素,约1h后在细胞表面表达,4~8h达到高峰,可持续24~48h。
   
  E-选择素也是介导白细胞与内皮细胞起始粘附作用的重 要分子,它除参与介导多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)的粘附作用外,还可介导单核细胞和静止的CD4 + 记忆性T细胞亚群粘附于细胞因子活化的内皮细胞。此外,嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞亦可与选择素E结合。E-选择素介导的粘附作用既不依赖于白细胞的活化,也不需要白细胞整合素的参与。内皮细胞上的E-选择素可锚定白细胞,继而介导其活化,因而有助于白细胞稳定地粘附于内皮细胞,继而迁移至血管外组织 [9] 。但是,Lundberg等认为AP时,E-选择素的上调与肺内CD18阳性白细胞浸润密切相关,认为E-选择素可能介导了CD18阳性白细胞的粘附[11] 。
   
  本研究结果显示,正常大鼠肺组织E-选择素几乎不表达或呈低水平表达(0.17±0.06);诱导胰腺炎后1h,大鼠肺组织内E-选择素mRNA表达略有增加(0.18±0.02),但是,与正常组比较两者之间差异无显著性;胰腺炎诱导4h后,大鼠肺组织内E-选择素mRNA表达明显增加,至12h达到最高水平(1.14±0.10);及至24h(0.82±0.20),大鼠肺组织内E-选择素mRNA表达较12h组明显减少,但仍高于正常水平。相关性分析提示大鼠肺组织内E-选择素mRNA表达水平与胰腺损伤程度、肺损伤程度成正相关关系,其相关系数分别为0.725、0.795。上述结果表明大鼠肺组织内E-选择素表达的增加参与了胰腺炎肺损伤的早期过程。
   
  有研究表明,E-选择素的表达依赖于NF-κB的激活和核易位 [2] 。因此,能够抑制NF-κB亚单位活性的糖皮质激素、生理抗凝因子蛋白C的体外重组活性形式,以及E-选择素特异性抗体、高密度脂蛋白、NO等能够抑制E-选择素表达增高的物质,可能有助于胰腺炎肺损伤的减轻。
    
  参考文献
    
  1 Steer ML.Relationship between pancreatitis and lung diseases.Respi-ration Physiology,2001,128:13-16.
   
  2 Shields CJ,Winter DC,Redmond HP.Lung injury in acute pancreati-tis:mechanisms,preventin,and therapy.Current Opinion in Critical Care,2002,8:158-163.
   
  3 Aho HJ,Koskensalo ML,Nevalainnen TJ.Experimental pancreatitis in the rat:Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroenterol,1980,15:411-416.
   
  4 Schmidt J,Lewandrwsi K,Warshaw AL,et al.Morphometric charac-teristics and homogeneity of a newmodel of acute pancreatitis in the rat. Int J Pancreatol,1992,12:41-51.
   
  5 Pozsar J,Berger Z,Simonk,et al.Biphasic effect of prostaglandin E1on the severity of acute pancreatitis infuced by a closed duodenal loop in rats.Pancreas,1996,12:159-164.
   
  6 Hofbauer B,Saluja AK,Bhatia M,et al.Effect of recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase on two models of experiment acute pancreatitis.Gastroenterology,1998,115:1238-1247.
   
  7 Kogire M,Inoue K,Higashide S,et al.Protective effects of endothelin-1on acute pancreatitis in rats.Dig Dis Sci,1995,40:1207-1212.
   
  8 Bevilacqua MP,Stengelin S,Gimbrone MA,et al.Endothelial leuko-cyte adhesion molecule1:An inducible receptor for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins.Science,1989,243:1160.
   
  9 毕爱华,龚非力.医学免疫学.北京:人民军医出版社,1995,44-92.

  10 Wayne SC.Leukocyte-endothelial cell interactions.Seminars Hema-tol,1993,30(Suppl4):45-55.
   
  11 Lundberg AH,Grangr DN,Pussell J,et al.Quantitative measurement of P-and E-selectin adhesion molecules in acute pancreatitis.Ann Surg,2000,231:213-222.
    

  作者单位:100054首都医科大学附属北京佑安医院肝胆外科(首都医科大学2000级博士研究生)
   
          首都医科大学宣武医院普外科


医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《粘附分子E-selectin在急性胰腺炎大鼠肺组织中的表达》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: