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CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶功能性基因片段的克隆及其序列分析

来源:INTERNET 作者:袁虹 陆坚 2005-7-21
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摘要: 【摘要】 目的 探讨CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)产生的遗传学背景及其基因结构特征。方法 质粒接合和电转移实验、质粒谱分析进行CTX-M-14型基因的质粒定位,质粒酶切基因文库(鸟枪法)技术克隆产CTX-M-14功能性基因片段,核苷酸序列测定及其计算机辅助在线分析以了解CTX-M-14基因的结构和功能特征。结果 CTX-M......


   【摘要】 目的 探讨CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)产生的遗传学背景及其基因结构特征。方法 质粒接合和电转移实验、质粒谱分析进行CTX-M-14型基因的质粒定位,质粒酶切基因文库(鸟枪法)技术克隆产CTX-M-14功能性基因片段,核苷酸序列测定及其计算机辅助在线分析以了解CTX-M-14基因的结构和功能特征。结果 CTX-M-14基因定位在85kb可转移多重耐药质粒上;采用鸟枪法克隆到1.8kb、2.4kb、3.1kb产CTX-M-14的功能性基因片段,序列分析显示其定位在耐药质粒上转座子基因结构中。结论 CTX-M-14型ESBLs基因定位在接合性耐药质粒的基因转位元件-转座子上,并可借之介导传播。
   
  关键词 超广谱β-内酰胺酶 分子克隆 DNA序列分析 质粒 转座子 

  【文献标识码】 A    【文章编号】 1680-6115(2004)07-0579-04
    
  Cloning,sequence analysis of functional gene fragment producing 

  CTX-M-14type extended-spectrumβ-lactamase  

  Yuan Hong,Lu Jian
    
  Donghu Hospital,Shenzhen,Guangdong518020.

    【Abstract】 Objective To investigate the genetic background and the gene structural characteristic of the proˉduction of CTX-M-14type ESBLs.Methods Plasmid transfer experiment and plasmid profile analysis was carried out for CTX-M-14gene location,shotgun cloning experiment with restriction enzyme-digested drug resistance plasmid for cloning the functional gene fragment producing CTX-M-14ESBLs,DNA sequencing and analysis aided by computer program on the internet was also implemented for understanding the characteristic of CTX-M-14gene structure and function.Results CTX-M-14gene is located on a85kb self-conjugative multiple drug resistance plasmid;the functional gene fragments producing CTX-M-14,1.8kb,2.4kb and3.1kb in size,were cloned by shotgun cloning experiment,DNA sequencing showed that CTX-M-14gene was located at transferable gene eleˉments transposon which on the resistance plasmid.Conclusion The dissemination of CTX-M-14type gene could be mediated by transferable resistance plasmids or transposon gene element.

    Key words extended-spectrumβ-lactamase cloning,molecular sequence analysis,DNA plasmid transposon
      
  CTX-Ms型酶是一组逐渐被认识且家族成员日益庞大的A类β-内酰胺酶,归属于Bush功能分类法2be组的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)家族;以对头孢噻肟高水平耐药为主要表型特征 [1]  。

  1990年德国学者Bauernfeind首次从一株临床分离的大肠杆菌耐药质粒上克隆到了该家族的第一个成员CTX-M-1(或MEN-1)。此后,该酶系各种新的亚型被不断发现,目前已正式撰文命名至CTX-M-21 [2]  。研究资料显示,CTX-M型ESBLs产酶株的菌谱及地域分布极为广泛,是导致某些地区ESBLs产酶株传播或流行的主要基因型 [3~5]  。我们的研究表明,CTX-M-14型酶是华南地区医院感染ESBLs产酶株中最为常见的基因型[5]。为了对其遗传学背景及分子结构特征进行深入研究,我们采用分子生物学技术对CTX-M-14型基因功能片段进行了克隆定位及其序列分析,结果如下。

  1 材料与方法

    1.1 菌株和质粒 见表1。

  1.2 主要试剂 药敏纸片及M-H(Mueller-Hinton)琼脂或肉汤培养基为英国Oxoid公司产品;E-试验条为瑞典AB BIODISK公司产品;限制性内切酶、碱性磷酸酶、DNA分子量标准、dNTP、Ex Taq酶、PCR产物纯化试剂盒、pMD18-T载体及DNA Ligation试剂盒购自TaKaRa公司;质粒提取、纯化试剂盒为QiaGen公司产品;测序试剂盒为ABI公司产品;PCR引物委托上海生工生物工程公司合成。

    1.3 药敏实验及最低抑菌浓度(MIC)测定 采用Kirby-Bauer法进行药物敏感性检测,E-试验进行MIC值检测。药敏判断及ESBLs表型筛选和确认标准按NCCLS2001年版的规定进行。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

    1.4 质粒转移实验及分析 天然耐药质粒的接合传递实验参照文献 [3]  进行,接合子在含头孢噻肟(2μg/ml)和利福平(300μg/ml)的Mueller-Hinton琼脂平板上进行筛选。重组质粒采用电转化实验进行,QiaGen Plasmid Mini Kit提取质粒后,用基因导入仪导入E.coli JM109,条件为:电压2.5kV,电阻200Ω,电容25μf,电转化子在含头孢噻肟(2μg/ml)的

  表1 研究用菌株和质粒略

    选择培养基上进行筛选,电感受态细胞制备参照文献 [6]  进行。接合子或电转化子重新用Kirby-Bauer法进行ESBLs表型确认。

    天然耐药质粒提取、纯化后,用0.8%琼脂糖进行电泳,采用LabImage软件分析与E.coliV517所携带质粒比较的结果,以确定其分子量大小;重组质粒经限制性内切酶酶切后,用1.2%琼脂糖进行电泳,以λDNA/Hind IIIMarker为分子量参照标准进行分析,用凝胶成像系统观察结果并照相。

    1.5 鸟枪法克隆ESBLs功能基因片段及其序列测定 QiaˉGen Plasmid Midi Kit提取接合子耐药质粒,用Sau3AⅠ进行不完全酶切(0.5U酶/μg质粒DNA),琼脂糖凝胶电泳回收1~3kb大小的酶切片段,与BamHⅠ酶切并与去磷酸化的克隆载体pACYC184进行连接重组,取连接反应体系10μl电转化100μl感受态E.coli JM109,具有ESBLs表型特征的重组子在含头孢噻肟(2μg/ml)的Mueller-Hinton琼脂平板上进行筛选。筛出的重组子重新用Kirby-Bauer法进行表型确认。根据克隆载体BamHⅠ位点的上、下游序列设计测序引物,并采用引物步移的
方法对具有ESBLs功能特性的插入片段进行全序列双向测序。自动测序仪为ABI PRISMTM377,测序试剂为BigDye terminator V2.0。

    1.6 核苷酸序列的计算机辅助分析 ESBLs功能性基因片段的读码框分析、氨基酸序列推导以及类似性检索采用美国国家信息中心(NCBI)的在线分析工具ORF finder和Blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)程序进行。

  2 结果

    2.1 CTX-M-14型ESBL的基因定位 对临床分离株E.coli SUN-100及其接合子E.coli CSUN-100的质粒进行电泳分析表明,85kb的耐药质粒被成功转移,使接合子获得了ESBLs表型特征及对氨基糖苷类抗生素的抗药性,见图 1。结果提示CTX-M-14型酶基因定位在85kb大小、可转移天然多重耐药质粒上。

    图1 产CTX-M-14临床分离株及其接合子的质粒电泳图谱略

    2.2 鸟枪法克隆ESBLs基因及重组质粒鉴定 pACYC184 质粒克隆载体具有四环素和氯霉素抗性基因(Tc  r 和Cm  r ),及Hind III、BamH I、EcoR I单一酶切位点。BamH I与Sau3AⅠ酶切片段具有对合末端,其位点位于Tc  r 基因内,如ESˉBLs功能性基因片段插入则Tc  r 失活、重组质粒具备ESBLs表型特征。

    采用鸟枪法,即酶切基因文库技术,将1~3kb大小的天然质粒pSUN-8Sau3AⅠ酶切片段克隆入BamH I酶切及去磷酸化的pACYC184载体。经抗性筛选及ESBLs表型验证,得到插入片段约为1.8kb、2.4kb、3.1kb3种大小的重组质粒,选择插入片段1.8kb的重组质粒pACYC184-14R进行进一步研究。

    酶切分析显示,pACYC184及pACYC184-14R分别被Hind III及EcoR I双酶切为约1.5kb、2.7kb和1.5kb、4.5kb各两个片段,提示pACYC184-14R含有1.8kb的插入片段,见图2。表2示,携带pACYC184-14R重组质粒的菌株对头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸复合制剂的MIC值分别为>256μg/ml和0.125μg/ml,具备了ESBLs表型特征。

    2.3 ESBLs基因功能片段的测序及分析 设计两对测序引物,对重组质粒pACYC184-14R1.8kb的插入片段进行测序分析,共测得1861个核苷酸。采用计算机辅助在线分析,发现了一长度为876bp的开放性读码框,共编码292个氨基酸,信号肽裂解位点推测在第29位氨基酸处,具备了Class A组酶四个保守序列的特征,即:氨基酸第70~73位S(Ser)XXK(Lys)四联体(X代表任意氨基酸残基)、第130~132位S(Ser)D(Asp)N(Asn)和第234~236位K(Lys)T(Thr) G(Gly)三联体及第166位的E(Glu);与GenBank注册号 AF252622的编码序列完全一致,证实为CTX-M-14型ESˉBL。 M:λDNA/HindIII Marker

    1:pACYC184/EcoR1+HindIII双酶切

    2:pACYC184-14R/EcoR1+Hind III双酶切

  图2 产CTX-M-14重组质粒酶切电泳图谱略

  表2 CTX-M-14产酶株MICs值的检测略

    对CTX-M-14上游序列分析显示:启动子-35位点的基序为TTGAAG,-10位点的基序为TTTAGG,核糖体结合位点(RBS)的基序为GGGAG。此外,在启动子结构上游250bp处发现了转座酶A部分编码序列,提示CTX-M-14型酶可能定位在基因转位元件—转座子上。

  3 讨 论

    CTX-Ms型酶主要产自克雷伯氏菌属、大肠杆菌和沙门氏菌属,目前已发现了至少23种以上的基因亚型(包括TOHO-1和TOHO-2),均定位在细菌染色体外的遗传物质-质粒上 [2]  。与TEM或SHV型ESBLs衍化酶不同,CTX-Ms型ESBLs未发现明确的广谱酶衍生背景,其产生机制 仍不明确。基因序列同源性及G+C含量分析显示,CTX-Ms型酶与产酸克雷伯氏菌染色体介导的A类酶高度同源性,可能为染色体来源并通过某些未知的迁移机制转位到质粒上,从而导致其耐药性播散 [3,4]  。根据Genebank数据库序列信息分析,CTX-M-9和CTX-M-15、CTX-M-21型酶基因就定位在耐药质粒可转移基因元件:I型整合子或转座子上。本研究通过对鸟枪法克隆到的CTX-M-14全基因功能片段进行测序后发现,该基因片段位于转座酶A编码区的下游,表明其位于转座子基因结构中,并可能通过转座子介导在细菌不同的遗传物质间播散 [7]  。上述研究提示,除质粒外,整合子或转座子等可以自行迁移的DNA亚转座元件在介导CTX-Ms型酶产生或播散方面可能发挥着重要的作用。

  参考文献

    1 Bush K,Jacoby GA,Medeiros AA,et al.A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular strucˉture.Antimicrob Agents Chemother,1995,39:1211-1233.

  2 Http://www.lehey.org/studies/webt.htm.

    3 Bonnet R,Sampaio JL,Labia R,et al.A novel CTX-M beta-lactaˉmase(CTX-M-8)in cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isoˉlated in Brazil.Antimicrob Agents Chemother,2000,44:1936-1942.

    4 Nordmann P.Trends in beta-lactam resistance among Enterobacteriˉ aceae.Clin Infect Dis,1998,27(Suppl1):S100-106.

    5 陆坚,唐英春,吴本权,等.华南地区质粒介导超广谱β-内酰胺酶的基因分型研究.中华微生物学和免疫学杂志,2002,22(6):638-643.

    6 Maloy SR,Stewart VJ,Taylor RK.医用细菌遗传学实验指南.徐建国,译.北京:科学出版社,1998,307-308.

    7 Bonetti B,Fu L,Moon J,et al.The efficiency of translation termination is determined by a synergistic interplay between upstream and downˉstream sequences in Saccharomyces cerevisiae.J Mol Biol,1995,251:334-348.     

  作者单位:518020广东省深圳市东湖医院 

  (收稿日期:2004-06-20) (编辑刘 静)


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