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氧自由基在大鼠阿霉素肾病发生中的作用探讨

来源:INTERNET 作者:匡裕玖 周建华 2005-7-19

摘要: 【摘要】 目的 制作大鼠微小病变型肾病模型,探讨氧自由基在肾病发生中的作用。方法 采用一次性尾静脉注射阿霉素(7mg/kg)制作大鼠微小病变型肾病模型,动态观察尿蛋白、血浆蛋白、肾功能及肾组织病理变化以及血和肾组织丙二醛(MDA)的含量。结果 阿霉素注射2周后所有大鼠均出现蛋白尿,第4周达到最高峰,之后反而有所......


    【摘要】 目的 制作大鼠微小病变型肾病模型,探讨氧自由基在肾病发生中的作用。方法 采用一次性尾静脉注射阿霉素(7mg/kg)制作大鼠微小病变型肾病模型,动态观察尿蛋白、血浆蛋白、肾功能及肾组织病理变化以及血和肾组织丙二醛(MDA)的含量。结果 阿霉素注射2周后所有大鼠均出现蛋白尿,第4周达到最高峰,之后反而有所下降;光镜下肾小球形态基本正常,第4周开始出现肾小管扩张,第8周和第16周时肾小管扩张更加明显,如小囊状。免疫酶标检查未发现沉积物;电镜下足突完全融合;肾皮质MDA在阿霉素注射后第3天即见升高,3天后各组肾皮质MDA含量也明显高于注射前,而血清MDA水平在第4周后才高于对照组,差异有显著意义。结论 大鼠阿霉素肾病模型蛋白尿、血生化及病理特点与儿童微小病变型肾病极为相似,氧自由基在肾病发生中起重要作用。

关键词 阿霉素肾病 氧自由基 发病机制

Oxygen free radicals in the pathogenesis of adriamycin

induced nephropathy in rats

Kuang Yujiu,Zhou Jianhua

Department of Pediatrics,Tongji Hospital,Tongji Medical College of

Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430030.

【Abstract】 Objective To establish a rat model of minimal change nephropathy and to study the role of oxyˉgen free radicals in the pathogenesis of nephrosis.Methods The rat model of minimal change nephropathy were proˉduced throughone intravenous injection of adriamycin at a dosage of7mg/kg and the time course change of urine proˉtein,blood biochemistry,renal pathology and malondialdehyde(MDA)levels in serum and renal cortex were observed in the rats after adriamycin injection.Results All rats developed proteinuria at the2nd week after adriamycin injecˉtion,moreover the proteinuria reached the highest level at the4th week and then decreased a little;The glomeruli were nearly normal,but the tubular enlargement was noted at4weeks and became more obvious at8weeks and16weeks after adriamycin injection.No immunoglobulin deposits were observed in the rats,and the electronic microscopy showed complete effusion of the foot process.In renal cortex increased MDA levels were noted in renal cortex at the3rd day after adriamycin injection and in serum after the4th week,the differences were significant.Conclusion Adriˉamycin-induced nephrosis in rats was similar to childhood minimal change nephropathy in proteinuria,blood bioˉchemistry and renal pathological changes.The oxygen free radicals might play important role in the pathogenesis of nephrosis.

Key words Adriamycin-induced nephrosis oxygen free radical pathogenesis

微小病变型肾病是儿童肾病综合征中最常见的病理类型,其发生尚不十分清楚。阿霉素肾病模型与人类微小病变型肾病在病理特点、血生化改变等方面极为相似而广泛用于该病的研究,但其发生机制尚不清楚。由于阿霉素心脏毒性与氧自由基有关,因此推测氧自由基在阿霉素诱发大鼠肾病过程中起重要作用 [1] 。本文建立大鼠阿霉素肾病模型并对肾组织中丙二醛(MDA)含量进行测定,以探讨其在肾病发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

1.1.1 实验动物 纯种Wistar雌性大鼠,每只重190~210g,同济医院动物实验中心提供。

1.1.2 试剂 阿霉素:Pharmacia公司,产品批号8046AA。 四乙氧基丙烷为美国Aldrich公司产品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠阿霉素肾病模型的建立、实验动物分组及标本收集 参照Bertani方法 [1]采用一次性尾静脉注射阿霉素(7mg/kg)制作大鼠阿霉素肾病模型。42只大鼠随机分为5组,6只以尾静脉注射生理盐水1ml作对照,余36只作为模型组并分别于注射后定期于1天、3天、1周、2周、3周、4周、8周、16周时置于代谢笼内收集24h尿液,动态观察尿蛋白,并于注射后3天、1周、2周、4周、8周、16周处死动物,收集血液及肾组织检测,并在0℃下制成肾皮质匀浆检测MDA含量。

1.2.2 检测方法 (1)24h尿蛋白以考马斯亮兰G250法测定。以正常大鼠24h尿蛋白含量的均值加上2个标准差为正常大鼠尿蛋白含量的上限,超过此值即为蛋白尿,以>40mg/24h为大量蛋白尿。(2)血清总蛋白及白蛋白以双缩脲法测定、血清胆固醇以醋酐-硫酸法测定、血肌酐以苦味酸比色法测定。(3)尿蛋白SDS-PAGE电泳:制备10%浓缩胶及7.5%分离胶,尿样本经SDS处理后电泳,待溴酚兰指示剂达终点后停止电泳,以考马斯亮兰R250染色观察。(4)肾组织病理检查:大鼠处死后,切取肾皮质3块。作HE、PAS、Masson、PAM四种染色并光镜观察,冰冻切片行间接免疫酶标法IgG、IgA、IgM、C3检查和电镜检查。(5)MDA含量的测定:采用硫代巴比妥酸法。每次均以复管制作标准曲线,样本测定如见混浊则另行重测。(6)统计学方法:计量资料t检验

2 结果

2.1 阿霉素注射后大鼠24h尿蛋白含量的变化 见表1。 在阿霉素注射后第3天即有9/36大鼠出现蛋白尿,1周时24/30出现蛋白尿,且9/30为大量蛋白尿,2周后所有大鼠均出现蛋白尿,22/24为大量蛋白尿,3周以后所有大鼠均为大量蛋白尿。在阿霉素注射后第1天大鼠24h尿蛋白定量低于注射前,差异有非常显著意义(t=3.0508,P<0.01)。在阿霉素注射后1~2周尿蛋白增加最快,2周后在 高水平上又逐渐增加,第4周达到最高峰,之后反而有所下降。

2.2 阿霉素注射后大鼠血清蛋白、胆固醇、肌酐含量的变化 见表2。

表1 阿霉素注射后大鼠24h尿蛋白含量的变化 (mg/24h,ˉx±s)

注:与注射前相比, ˇ P<0.01, ˇˇ P<0.001

表2 阿霉素注射后大鼠血清蛋白、胆固醇、血肌酐含量变化(ˉx±s)

注:与注射前相比, ˇ P<0.01, ˇˇ P<0.001

由上表所见,阿霉素注射后,大鼠血清总蛋白、白蛋白逐渐降低,胆固醇逐渐增高,1周时血清蛋白降低而胆固醇正常,以后各组的变化与对照组相比差异有非常显著性意义,而血肌酐在各组间差异均无显著性,这种血生化紊乱与人类微小病变型肾病极为相似。

2.3 大鼠阿霉素肾病尿蛋白SDS—PAGE电泳结果 对各组尿蛋白进行SDS—PAGE电泳发现,各组尿蛋白主要区带在白蛋白上下,与人类微小病变肾病尿蛋白电泳结果基本一致,8周以后尚可见少量中、高分子量的蛋白带。

2.4 肾脏组织病理变化 各组动物肾脏大小及质地均未见明显变化。光镜下肾小球形态基本正常,未见内皮细胞、系膜细胞增殖,无毛细血管基底膜增厚、分层等异常改变。第1周开始少数肾小管出现蛋白管型及肾小管浊肿、上皮脱落,并在以后各组逐渐增多。第4周开始出现肾小管扩张,第8周和第16周时肾小管扩张更加明显,如小囊状。免疫酶标检查未发现沉积物。注射后3天即可在电镜下见局灶性足突融合,以后逐渐加重,第2周后各组足突完全融合,基底膜未见异常,亦无电子致密物沉积。上述改变均与人类微小病变肾活检结果较为相似。

2.5 肾病大鼠血清及肾皮质匀浆中MDA含量变化 见表3。 由上表3可知,阿霉素注射后3天即见肾皮质MDA升高,3天后各组肾皮质MDA含量也明显高于注射前,差异有显著意义。阿霉素注射后4周、8周及16周大鼠血清 MDA水平明显高于对照组,差异有显著意义。

表3 阿霉素注射后大鼠血清及肾皮质MDA含量变化 (ˉx±s)

注:与注射前相比, ˇ P<0.05

3 讨论

本文参照Bertani方法制作大鼠阿霉素肾病模型,发现所有大鼠经注射阿霉素后均出现大量蛋白尿。最早者在注射后第3天就见蛋白尿,1~2周尿蛋白增加最快,4周达高峰,此后有所减低但仍持续在高水平上。光镜下肾小球病变轻微,无免疫复合物沉积,电镜下仅见足突融合,因此属微小病变,肾小管于第1周出现蛋白管型及肾小管浊肿、上皮脱落,以后逐渐增多。第4周开始出现肾小管扩张,第8周和第16周时肾小管扩张更加明显,如小囊状。病理改变与Javaid等 [2] 报道的相仿。血生化及肾功能的检查结果也与儿童微小病变型肾病相似。该模型制作所需阿霉素药源广,易于购得,制作方法简单,重复性好,适宜于微小病变型肾病的研究,值得推广。但制作


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