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兔脑缺血再灌注后细胞凋亡与TIMP-1表达的特点

来源:齐鲁医学杂志 作者:李增伟1,刘松2,李滢2,刘学军2,隋庆兰2 2011-6-30

摘要: 【摘要】 目的探讨兔脑缺血再灌注后细胞凋亡和基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的特点。方法成年健康新西兰兔103只,应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)动物模型,将成功的60只兔MCAO模型随机分为永久性缺血组和缺血再灌注组,各30只。原位末端标记法检测两组脑组织细胞凋亡的情况,免疫组织化学方法检测脑组......


【摘要】  目的探讨兔脑缺血再灌注后细胞凋亡和基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的特点。方法成年健康新西兰兔103只,应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)动物模型,将成功的60只兔MCAO模型随机分为永久性缺血组和缺血再灌注组,各30只。原位末端标记法检测两组脑组织细胞凋亡的情况,免疫组织化学方法检测脑组织TIMP-1表达的情况。结果脑缺血后脑组织细胞凋亡数逐渐增多,缺血12 h达高峰,以后逐渐减少(F=14.48,q=4.79~9.39,P<0.01)。缺血1 h时脑组织TIMP-1阳性细胞数逐渐增多,48 h达高峰(F=52.05,q=4.98~19.43,P<0.01)。动物缺血1 h再灌注后,各时间点凋亡细胞数和TIMP-1表达都低于永久性缺血组,再灌注23 h阳性细胞数最多,再灌注47 h下降(F=8.34、53.34,q=3.10~18.70,P<0.01)。结论急性脑缺血再灌注后,细胞凋亡与TIMP-1表达一致。

【关键词】  再灌注损伤;细胞凋亡;基质金属蛋白酶抑制因子;兔

  ObjectiveTo study the characteristics of apoptosis and expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in rabbits after cerebral ischemia and reperfusion.MethodsA total of 103 adult healthy New Zealand rabbits were used for the study. A model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was successfully created in 60 rabbits with filament ligation method, which were equally randomized to permanent ischemia (PI) group and ischemia-reperfusion (IR) group. The tissue apoptosis was determined with TUNEL assay and immunohistochemisty used to tdetect the expression of TIMP-1 in cerebral tissue.ResultsAfter cerebral ischemia, the number of apoptotic cells increased gradually and reached the peak at 12 h, and then the number began to decrease gradually (F=14.48,q=4.79-9.39,P<0.01). The expression of TIMP-1 enhanced 1 h after ischemia, reaching the peak at 48 h (F=52.05,q=4.98-19.43,P<0.01). The number of cell apoptosis (F=8.34,q=3.10-7.36,P<0.01) and TIMP-1 expression (F=53.34,q=6.47-18.70,P<0.01) in those reperfusion after ischemia for 1 h were significantly lower at all time points than that in PI group. The number of cells reached the greatest level 23 h after reperfusion, and then began to decrease at 47 h.ConclusionThe expression of TIMP-1 was in accordance with cell apoptosis after acute ischemia-reperfusion.

  [KEY WORDS]reperfusion injury; apoptosis; tissue inhibitor of metalloproteinase; rabbits

  脑缺血再灌注可因损伤血-脑脊液屏障(BBB)引起血管源性脑水肿,甚至脑疝的发生,增加急性期脑梗死病人的病死率[1]。近年研究结果显示,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在缺血早期BBB损害中起重要作用,基质金属蛋白酶抑制因子-1 (TIMP-1) 是MMP-9的内源性抑制剂,TIMP-1与MMP-9表达的变化对BBB的完整性起重要作用[2-3]。本研究为了探讨急性脑缺血再灌注后不同时期脑组织细胞凋亡和TIMP-1表达的变化规律,分别采用原位末端标记法和免疫组化法对细胞凋亡和TIMP-1表达进行了检测。现将结果报告如下。

  1材料与方法

  1.1模型建立

  成年健康新西兰兔103只,雌雄不限,体质量2.3~3.3 kg,SPF级,由山东省农业科学院实验动物中心提供(SCX20040013)。动物均于实验前置于实验室适应环境1周,自由进食、饮水;室温(23±2)℃,自然光照,术前禁食12 h。随机选择10只作为假手术组,其余动物应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。术中保持肛温37 ℃。顺利完成插线后1 h经磁共振成像(MRI)检查DWI像出现片状高信号区者为模型制作成功[4]。将60只成功的动物模型随机分为永久性缺血(I)组和缺血再灌注(R)组各30只。其中,I组再分为I1~I6组,即缺血1、3、6、12、24和48 h组,每组5只;R组再分为R1~R6组,即缺血1 h再灌注0、2、5、11、23和47 h组。

  1.2石蜡切片制备

  各组动物在相应时间点以100 g/L水合氯醛0.3 mL腹腔注射麻醉后,依次用生理盐水、40 g/L甲醛溶液各200 mL经心脏灌注固定后断头取脑,置于40 g/L甲醛溶液后固定2 h,蒸馏水浸泡4 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。自视交叉后方开始连续冠状位切片,厚度7 μm,贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上,4 ℃保存备用。

  1.3细胞凋亡检测

  采用原位末端标记法(TUNEL),细胞凋亡试剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。严格按照说明书上的步骤进行操作,显微镜下观察阳性细胞为棕黄色时终止反应,阴性对照切片不加探针,用浓度0.01 mol/L的PBS代替,不出现阳性反应。光镜下观察皮质和纹状体区的阳性细胞数,各取4个高倍视野(400倍)计数细胞。

  1.4免疫组化检测

  兔抗兔TIMP-1单克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒、DAB染液均购于武汉博士德生物工程有限公司。严格按说明书染色步骤操作。光镜下观察胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。阴性对照切片不加一抗,用0.01 mol/L的PBS代替,不出现阳性反应。每只动物取4张连续切片,在光镜下观察皮质和纹状体区的阳性细胞数,各取4个高倍视野(400倍)计数细胞。

  1.5统计学处理

  数据均采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[5]统计软件处理。

  2结果

  各组皮质区和纹状体区凋亡细胞数和TIMP-1阳性细胞数差异无显著性,故合并统计。

  2.1I组细胞凋亡数与TIMP-1阳性细胞数

  动物在缺血1 h即出现凋亡细胞,而且随时间延长阳性细胞数逐渐增多,缺血12 h阳性细胞数达高峰,以后阳性细胞数又逐渐减少(F=14.48,q=4.79~9.39,P<0.01)。缺血1 h时,TIMP-1即开始表达,阳性细胞数明显增加,随时间延长TIMP-1表达增多,到缺血48 h时达高峰(F=52.05,q=4.98~19.43,P<0.01)。见表1。

  2.2R组细胞凋亡数与TIMP-1阳性细胞数

  动物缺血1 h再灌注后,凋亡细胞数缓慢上升,再灌注23 h平均凋亡细胞数最多,再灌注47 h凋亡细胞数下降(F=8.34,q=3.10~7.36,P<0.01),各时间点凋亡细胞总数均呈低于永久缺血组的趋势。动物缺血1 h再灌注2 h后TIMP-1表达增多,再灌注23 h达高峰(F=53.34,q=6.47~18.70,P<0.01),但表达程度呈低于永久缺血组的趋势。见表2。表1I组细胞凋亡数和TIMP-1阳性细胞数表2R组细胞凋亡数和TIMP-1阳性细胞数

  3讨论

  MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员之一,激活时能降解参与BBB基膜的主要成分Ⅳ型胶原、层粘蛋白和纤粘蛋白等,过度表达的MMP-9可破坏血管基底膜,引起BBB的通透性升高,导致血管源性水肿、血循环中炎性细胞渗入及继发出血等[6]。TIMP-1是MMP-9的内源性抑制剂,由结缔组织细胞和巨噬细胞产生,同时多种细胞因子能诱导其分泌。它主要通过酶原活化阶段与proMMP-9形成稳定的复合物来阻碍酶原的自我激活,同时MMP-9活化后与TIMP-1以1∶1非共价键形成MMP-TIMP复合体,阻断MMP-9与底物结合而发挥作用[7]。二者在缺血早期逐渐增多,再灌注24~48 h达高峰,随着再灌注时间延长至第5天BBB关闭,表达显著降低,表明与BBB破坏有关[8]。

  BBB完整性破坏是脑缺血再灌注后脑水肿、炎性细胞浸润,进而导致神经细胞死亡的重要原因[9]。ROSENBERG等[10]研究显示,在缺血再灌注3和48 h BBB通透性明显增加,其中48 h通透性最大,同时发现TIMP-1也在48 h达最大量,且TIMP-1表达与MMP-9同步升高,提示TIMP-1可能抑制或削弱MMP-9的作用。本文研究结果显示,R组23 hTIMP-1表达达高峰,这与缺血再灌注BBB第2次开放时间相一致,而有研究结果显示此开放与MMP-9参与对BBB的破坏有关[11]。

  本文研究显示,随着脑缺血时间延长,脑组织凋亡阳性细胞数逐渐增多,缺血12 h阳性细胞数达高峰,以后阳性细胞数又逐渐减少,而TIMP-1到缺血48 h时达高峰,提示缺血诱导细胞凋亡,继而引发TIMP-1表达,对抗MMP-9等炎性因子导致的细胞凋亡。缺血1 h再灌注后,凋亡细胞数缓慢上升,再灌注23 h平均凋亡细胞数和TIMP-1阳性细胞最多,再灌注47 h凋亡细胞数下降,各时间点凋亡细胞总数均呈低于永久缺血组的趋势。提示再灌注恢复血液供应后,在一定程度上能减轻脑组织损伤。

【参考文献】
   \[1\]MACGREGOR D G, AVSHALUMOV M V, RICE M E. Brain edema induced by in vitro ischemia: causal factors and neuroprotection\[J\]. J Neurochem, 2003,85(6):1402-1411.

  \[2\]ROSELL A, ORTEGA A A, ALVAREZ S J, et al. Increased brain expression of matrix metalloproteinase-9 after ischemic and hemorrhagic human stroke\[J\]. Stroke, 2006,37(6):1399-1406.

  \[3\]KRIZAMAC-BENGEZ L, HOSSAIN M, FAZIO V, et al. Loss of flow induces leukocyte-mediated MMP/TIMP imbalance in dynamic in vitro blood-brain barrier model: role of pro-inflammatory cytokines\[J\]. Am J Physiol Cell Physiol, 2006, 291(4):C740-749.

  \[4\]刘学军,孔令琦,隋庆兰,等. 线栓法建立兔局灶性缺血再灌注模型研究\[J\]. 青岛大学医学院学报, 2006,42(1):37-39.

  \[5\]周晓彬,纪新强,徐莉. PPSM 1.5统计软件的功能及其应用\[J\]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):91-93.

  \[6\]BURGGRAF D, TRINKL A, DICHGANS M, et al. Doxycycline inhibits MMPs via modulation of plasminogen activators in focal cerebral ischemia\[J\]. Neurobiol Dis, 2007,25(3):506-513.

  \[7\]VISSE R, NAGASE H. Structure and function of matrix me-

  talloproteinases and TIMPs\[J\]. Cardiovasc Res, 2006,69(3):562-573.

  \[8\]SHIGEMORI Y, KATAYAMA Y, MORI T, et al. Matrix metalloproteinase-9 is associated with blood-brain barrier ope-

  ning and brain edema formation after cortical contusion in rats\[J\]. Acta Neurochir Suppl, 2006,96:130-133.

  \[9\]GIDDAY J M, GASCHE Y G, COPIN J C, et al. Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia\[J\]. Am J Physiol Heart Cire Physiol, 2005,289(2):H558-568.

  \[10\]ROSENBERG M D, ESTRADA B S, DENCOF B S, et al. Matrix metallo proteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain\[J\]. Stroke, 2002,33(9):2189.

  \[11\]NAGEL S, SU Y, HORSTMANN S, et al. Minocycline and hypothermia for reperfusion injury after focal cerebral ischemia in the rat-Effects on BBB breakdown and MMP expression in the acute and subacute phase\[J\]. Brain Res, 2008,1188:198-206.

  


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