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大鼠缺血后肢局部应用bFGF对血管新生的影响

来源:《齐鲁医学杂志》 作者: 2009-8-25
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摘要: 【摘要】 目的 观察不同月龄大鼠缺血后肢肌肉内局部应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对血管新生的影响。方法 Wistar大鼠40只,按月龄分为A组(4个月)和B组(16个月),A组又分为A1、A2组,B组又分为B1、B2组,每组10只大鼠。40只大鼠均切断左股动脉,制作后肢缺血模型。成模后A1和B1组大鼠缺血后肢肌肉内多次注......


【摘要】  目的 观察不同月龄大鼠缺血后肢肌肉内局部应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对血管新生的影响。方法 Wistar大鼠40只,按月龄分为A组(4个月)和B组(16个月),A组又分为A1、A2组,B组又分为B1、B2组,每组10只大鼠。40只大鼠均切断左股动脉,制作后肢缺血模型。成模后A1和B1组大鼠缺血后肢肌肉内多次注射重组牛bFGF蛋白;A2和B2组则给予等量生理盐水。术后4周,取各组大鼠内收肌组织行病理组织学检查,采用图像分析系统计算血管密度,免疫组化方法检测内收肌中VEGF阳性表达的血管数。结果 各组大鼠缺血后肢肌内血管密度及VEGF阳性表达的血管数比较,A1组多于A2组,B1组多于B2组,差异均有显著意义(t=3.30~3.50,P<0.05);其他各组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论 在不同月龄大鼠缺血后肢肌肉内注射bFGF蛋白可促进肢体血管新生,改善肢体缺血状态,且与月龄无关。

【关键词】  成纤维细胞生长因子2 新生血管化 生理性 缺血 大鼠 Wistar

目前,我国中老年人肢体缺血性疾病的发病率为5/10 000~10/10 000[1],很多病人由于肢体远侧流出道血管广泛闭塞,外科旁路手术或血管腔内治疗失败,药物治疗的效果有限,而最终不得不截肢。近年来研究显示,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有激活血管内皮细胞增殖和促进体内血管生成的作用[2]。目前关于bFGF治疗肢体缺血性疾病的实验研究多采用青年动物,已取得了一定的研究成果[3]。而关于bFGF治疗老年动物肢体缺血性疾病的研究不多。本文建立了4个月和16个月健康Wistar大鼠后肢缺血模型,观察缺血后肢肌内注射重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)对缺血组织血管新生的影响,现将结果报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料

    4个月和16个月清洁级健康Wistar大鼠各20只,体质量250~350 g,平均300 g,均为雌性,青岛市药检局动物实验中心提供。rb-bFGF购自珠海亿胜生物制药有限公司;兔抗大鼠血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;SP-9000二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。

    1.2  大鼠下肢缺血模型的制备及分组

    大鼠腹腔内麻醉(100 g/L水合氯醛,2.5 mL/kg)后,常规备皮、消毒、铺巾,经左侧腹股沟韧带中点(触及股动脉搏动后) 作一长约1~2 cm纵形皮肤切口,暴露股动脉,自其起始部分分离,用0号丝线结扎并切断,制成大鼠后肢缺血模型。按月龄分为A组(4个月)和B组(16个月),A组又分为A1、A2组,B组又分为B1、B2组,每组10只大鼠。

    1.3  给药及一般情况观察

    大鼠后肢缺血模型制备成功3 h后, A1和B1组大鼠在股动脉结扎处下方肌内均匀行5点注射,每点注射bFGF 40 U(约0.01 mL),第3、5、7天各重复1次,共4次。A2和B2组按同样方法给予等量的生理盐水。实验开始后,将大鼠置于室温24~27 ℃下,自然光照,每日定时供给足量鼠粮(青岛市药检局动物实验中心提供)及饮水,观察大鼠的一般状况,包括生命体征、饮食、切口愈合情况及左后肢活动情况等。

    1.4  微血管密度及VEGF阳性表达血管数测定

    术后4周处死大鼠,取左后肢内收肌中段肌肉组织1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm,用甲醛固定,石蜡包埋,按肌肉横断面切片,片厚5 μm,连续切10张,并行苏木精-伊红染色。切片经Mias-2000图像分析系统处理,计算血管密度。VEGF阳性表达血管数检测采用SP-9000二步法免疫组化试剂盒,按试剂盒说明书进行操作。血管内皮细胞胞浆染色呈棕黄色者为VEGF阳性表达细胞,该毛细血管即为VEGF阳性表达的血管。每一标本随机选取5个视野,在400倍显微镜下观察并计数VEGF阳性表达的血管数,取其平均值。

    1.5  统计学分析

    采用SPSS 11.5软件进行统计学处理,结果以±s表示,数据间比较用配对t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  大体观察

    B1组大鼠1只于术后第5天因切口感染死亡,其余3组大鼠实验及观察期间皆存活。在观察期间各组大鼠均未出现左后肢缺血性坏死,术后切口均愈合良好,但B1组大鼠3只出现活动障碍,其余3组大鼠没有出现活动障碍。

    2.2  各组毛细血管计数与VEGF阳性表达的血管数比较

    A1组大鼠血管密度及VEGF阳性表达的血管数均明显多于A2组,差异有显著性(t=3.30、3.45,P<0.05);B1组大鼠血管密度及VEGF阳性表达的血管数均明显多于B2组,差异有显著性(t=3.41、3.50,P<0.05);A1组与B1组、A2组与B2大鼠血管密度及VEGF阳性表达的血管数比较,差异无显著性(t=2.04~2.11,P>0.05)。见表1。表1  各组毛细血管计数与VEGF阳性表达的血管数比较

    3  讨    论 

    近年来,各种血管移植术及介入治疗技术等有了很大的发展,使许多病人缺血肢体得以保存,生活质量有所提高。但仍存在远期血管阻塞等诸多问题,另外,对膝关节以下小动脉阻塞、无远侧流出道的缺血肢体目前仍无有效的治疗手段,如何使这种组织缺血血流得到改善,从而减轻临床症状,避免肢体坏死正成为研究热点。

    成纤维细胞生长因子(FGF)[4],又称肝素亲和生长因子,按等电点不同分为bFGF和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。bFGF的生物学活性远大于aFGF。bFGF是动物和人体组织中存在的一种微量蛋白,对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛生物学活性,是一种多功能细胞因子[5],该因子是由146个氨基酸组成、相对分子质量18 000的小蛋白质分子,其等电点为9.6,呈碱性,对热和酸敏感,易被蛋白酶降解,与肝素有特异性亲和力。bFGF在体内分布极为广泛,脑、心、肝、肾、肾上腺、骨、眼和胎盘等都有bFGF存在。在心血管系统中,血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有合成bFGF的能力。bFGF可作用于内皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、卵巢颗粒细胞、上皮细胞、肾上腺皮质及髓质细胞、骨细胞、晶状体和角膜上皮细胞等。具有以下多种作用:①促进血管生成;②诱导中胚层形成;③促进肢体再生;④参与创伤修复过程,促进软组织、软骨组织和骨组织等损伤的修复;⑤具有神经营养作用,促进脑、脊髓组织损伤修复;⑥作用于中枢神经系统,抑制胃酸和胃蛋白酶的分泌,有利于溃疡的愈合;⑦影响内皮细胞功能,控制高血压和动脉粥样硬化;⑧影响免疫细胞活性,调节免疫系统功能等[6]。

    外周血管缺血性疾病的治疗要求增加局部组织血液的灌流量、减少组织低氧,从而改善肢体功能。bFGF是体内最为有效的血管生长因子之一,bFGF可趋化血管内膜的各类细胞,并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶和蛋白水解酶等;这些酶类通过促使血管基膜降解和刺激内膜各类细胞的增殖与迁移,诱导血管内皮细胞长入胶原基质中,形成管腔并促进神经元及新生血管共同生长。近年来,bFGF已被临床应用于治疗创伤、溃疡、神经系统及视网膜缺血等疾病[7]。

    BANAI等[8]研究显示,组织缺血后局部内源性bFGF表达增加,促进血管再生以适应缺血的变化,但此过程非常缓慢,而且bFGF增加的量不足以完全改善组织缺血状态。因此,在缺血组织内适时适量地增加局部外源性bFGF的量,将会加快血管新生的速度和增加血管新生的数量。本实验在大鼠缺血后肢肌内注射bFGF蛋白,可使侧支血管数增加。本实验还表明,对两个不同月龄组的大鼠缺血后肢肌内应用外源性bFGF蛋白,其促血管新生作用差异无显著性。说明大鼠肢体缺血后,其血管侧支循环的建立与月龄无关。

    总之,在不同月龄大鼠下肢缺血局部肌内注射bFGF蛋白可促进血管新生,增加缺血后肢血液灌注,改善肢体缺血状态。

【参考文献】
  [1]汪忠镐,张建,谷涌泉. 实用血管外科与血管介入治疗学〖M〗. 北京:人民军医出版社, 2004:247-259.

[2]崔世军,张建,俞恒锡,等. VEGF及bFGF基因治疗家兔肢体缺血的实验研究[J]. 北京医学, 2007,29(8):503-504.

[3]冯艳红,任卫东. 骨髓干细胞动员治疗不同月龄心肌梗死大鼠的实验研究[J]. 中国免疫学杂志, 2004,20(7):471-474.

[4]BOSSARD C, LAURELL H, VEN DEN BERGHE L, et al. Translokin is an intracellular mediator of FGF-2 trafficking[J]. Nat Cell Biol, 2003,5(5):433-439.

[5]DETILLIEUX K A, SHEIKH F, KARDAMI E, et al. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium [J]. Cardiovasc Res, 2003,57(1):8-9.

[6]刘莹,孙立军,宦怡,等. 碱性成纤维生长因子对急性心肌梗死血管生成和碱性成纤维生长因子及血管内皮生长因子表达的作用[J]. 中国医学杂志, 2004,84(1):54-57.

[7]袁春燕,赵颖,牛膺筠. 碱性成纤维细胞生长因子与视网膜缺血再灌注损伤[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(2):216-220.

[8]BANAI S, SHWEIKI D, PINSON A, et al. Up regulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischemia: implication for coronary angiogenesis[J]. Cardiovase Res, 2002,29(8):1276-1279.


作者单位:青岛大学医学院附属医院血管外科,山东 青岛 266003


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