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多重荧光标记STRPCR技术在骨髓移植后植入状态监测中的应用

来源:《齐鲁医学杂志》 作者:焦淑贤 2008-5-29

摘要: 【摘要】 目的 建立骨髓移植后植入状态监测的多重荧光标记短串联重复序列聚合酶链反应(STRPCR)检测方法,为骨髓移植病人移植疗效评价及干预治疗提供可靠依据。方法 于移植前、移植后7 d~3个月不同时间采集3例供受者静脉及骨髓血样,提取DNA作为模版,用多重荧光标记STRPCR方法检测其基因型。结果 2例供受......


【摘要】  目的 建立骨髓移植后植入状态监测的多重荧光标记短串联重复序列聚合酶链反应(STRPCR)检测方法,为骨髓移植病人移植疗效评价及干预治疗提供可靠依据。方法 于移植前、移植后7 d~3个月不同时间采集3例供受者静脉及骨髓血样,提取DNA作为模版,用多重荧光标记STRPCR方法检测其基因型。结果 2例供受者HLAA、B、DRB1等6个等位基因完全相合病人骨髓移植后分别于第35天和3个月转为完全供者型,1例HLA半相合母子移植病人持续未植入,移植后第7、28天STRPCR分析为受者基因型。结论 荧光标记STRPCR技术是骨髓移植后植入状态监测的有效方法,对移植效果有预测作用。

【关键词】  短串联重复序列 骨髓移植 基因型

    APPLICATION OF  STRPCR WITH FLUORESCENCE LABELLING SYSTEM ON MONITORING THE ENGRAFTMENT STATUS AFTER BONE MARROW TRANSPLANTATIONJIAO SHUXIAN, JI YUQIANG, HU BIN,  et al (Qingdao Blood Center,Qingdao 266071, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo establish a method of STRPCR with fluorescence labelling system in order to monitor bone marrow transplantation.MethodsFluorescence labeling STRPCR was established.DNA was extracted from peripheral blood and bone marrow nucleated cells and labeld with four color fluorescence before and from 7 days to 3 months after transplantation.

    ResultsTwo patients converted into full donor chimeras.One patient received HLA haploidentical sibling donor stem cells failed to be engrafted.ConclusionAnalysis of STR was a method of indication of engraftment and better than any other available methods.

    [KEY WORDS]short tandem repeats; bone marrow transplantation; genotype

    造血干细胞移植是目前治愈白血病惟一方法,但是移植后白血病复发是目前临床面临的最大问题[1,2],其主要原因是移植后病人体内仍然有少量存活的白血病细胞,因此有必要识别移植后移植物的植入状态,为临床使用免疫抑制药物提供可靠依据。本研究拟在分子水平建立预警技术——荧光标记PCR扩增短串联重复序列聚合酶链反应(STRPCR)技术,并结合毛细管电泳方法,对3例外周造血干细胞移植病人进行监测,现将结果报告如下 。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    研究病例来自青岛市中心医院、青岛市海慈医疗集团血液科2004~2005年外周血干细胞移植病人。病例1,男,16岁,患急性淋巴细胞性白血病,供者为其生母;病例2,女,36岁,患慢性粒细胞性白血病,供者为其胞妹;病例3,男,28岁,患再生障碍性贫血,供者为其胞兄。供、受者HLA基因配型采用PCRSSP方法,供受者配型结果见表1。表1  供受者HLA基因配型结果病例供受者

    1.2  研究方法

    1.2.1  标本采集  采集供者和受者术前ACD抗凝静脉血3.0 mL及术后7 d~3个月间受者骨髓血样3.0 mL,-20℃保存。

    1.2.2  DNA提取  取0.3 mL全血加入红细胞裂解液750 μL振荡混匀后,13 200 r/min离心1 min,弃上清液,加入白细胞裂解液300 μL振荡混匀,0 ℃放置1 min,加蛋白沉降液100 μL振荡混匀,以13 200 r/min离心1 min,去除上清液,加体积分数0.70的乙醇300 μL,离心去上清液后加100 μL DNA水化液。基因定量仪(Genequant,美国)测定浓度和纯度,调整浓度使其在0.05 mg/L,纯度在1.6~1.8之间。

    1.2.3  STRPCR检测  按照A mpF/STR IdentifiLerTM(American)试剂说明操作。PCR反应总体积25 μL,其中master mix 10.5 μL,Taq酶(0.5 U/μL, Promega公司),primer 5.5 μL,模版DNA(0.05 mg/L)10 μL。热循环参数如下:95 ℃预变性11 min;然后94 ℃ 热变性1 min,59 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸1 min,28次循环;60 ℃延伸60 min。

    1.2.4  毛细管电泳  取PCR产物1 μL,加入甲酰胺20 μL,GS500LIZ 0.5 μL,95℃变性5 min,迅速冰上冷却3 min。取变性产物20 μL加入测序仪(3 100 avant,ABI)96孔上样板内,采用POP4胶(Performance Optimized Polymer 4)在36 cm 毛细管中全自动电泳,电压3 000 V。收集数据1.5 h,GeneMapperTM Software version 3.5分析软件根据DNA片段长度,等位基因梯(Ladder)自动分析各位点等位基因型。

    2  结    果

    移植后供受者的STR基因型见表2。

    病例1为HLA半相合母子,虽然临床上症状缓解,但是移植后第7、28天荧光标记STRPCR技术没有检测到供者基因植入迹象。病例2、3移植后呈现完全植入状态,病人移植后造血重建,为完全供者型,受者血液完全由供者植入骨髓产生。表2  移植后供受者的STR基因型

    3  讨    论

    造血干细胞移植后通常用血型检验、性染色体监测、HLA分型、DNA指纹图谱、银染技术STR基因分型等方法检测移植物是否植入[3~5],但这些方法存在不同的缺点,且血型通常需在移植后2个月才能转变,不能早期识别。性染色体检测只能用于性别不同的病人且试验时间长;HLA分型对完全相合供受者无法使用且要求DNA量较多;DNA指纹图谱需要DNA量较大;银染技术STR基因分型仅能扩增单个遗传位点,受影子带、杂带等多种因素影响。因此,检测病人移植状态时常需要以上几种方法联合应用。微卫星即STR是由2~6 bp重复单位构成的DNA序列,通常多态性片段长为100~300 bp。以人类基因组为例,平均每15~20 kb就存在1个STR座位,据此估计整个人类基因组中大约有50 000~100 000个STR位点。由于它均有高度的多态性和遗传稳定性,所以非常适合作为遗传学DNA分子标记,利于微量DNA高效扩增,能敏感、清晰、微量和快捷地分析遗传基因。目前STR分析广泛用于遗传制图、连锁性分析、亲子鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域[6~8]。将荧光标记引物技术引入复合扩增中,允许各位点之间片段重叠,因此可以在1个反应体系同时扩增15个具有杂合度高的STR位点和1个性别基因。在1个泳道中同时电泳,利用相对分子质量内标、分型的时候,按照已知重复次数的等位基因Ladder与待测DNA片段在同一泳道电泳经过的路径相同的原理,判断各STR位点基因型。

    干细胞移植后受者体内细胞的嵌合状态分为供者细胞受者细胞混合嵌合状态和供者细胞完全嵌合状态。移植后的植入状态是判断移植是否成功,移植后免疫抑制剂的合理应用,判断疾病复发及临床复发前进行干预治疗的重要依据。对于异基因干细胞移植后植入状态的定性和定量分析,在国外的许多移植中心已成为常规的监测手段[9,10]。研究表明,STR是迄今为止惟一能从微量DNA进行遗传学分析的方法,可以敏感显示出骨髓移植物的植入状态。国内虽然也有检测微卫星DNA判断植入细胞存活与否的报道[11~13],但移植后多次检测的报道仍很少。

    本研究复合扩增16个微卫星基因座位,其无关个体识别率大于0.99 999 999,观察供者和受者移植前、后的微卫星分型图,就可以确定植入状态。本研究检测的受者中,2例HLA完全相合条件下亲缘供者完全持续植入达100%,临床症状和实验室检查结果表明造血重建完全由供者骨髓替代;而HLA半相合的病人则没有检测到植入,虽然临床症状缓解,但是对于供者植入迟缓的现象要高度关注移植物的排异反应,这对于病人的后继治疗提供了可靠的依据。

    总之,荧光标记STRPCR技术可以精确识别移植物植入状态,是骨髓移植后早期识别移植物植入、检测微小残留病变及预测移植效果的有效方法。根据临床表现和其他实验室检查结果,在移植后需要多次采血送检,进行动态监测,以确定治疗方案。

 

【参考文献】
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[13]邹红岩,李桢,邓志辉,等. 混合脐血成人移植定量监测植入状态的实验研究[J]. 中国实验血液学杂志, 2004,12(2):179184.


作者单位:青岛市中心血站,山东 青岛 266071


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