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GM-CSF及性激素水平对卵泡和早期胚胎发育的影响

来源:齐鲁医学杂志 作者:翟向红,孟珂 2006-12-20
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摘要: [摘要]目的 探讨超促排卵周期取卵日(OPU)卵泡液中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及性激素水平对卵泡发育、卵子受精、卵裂及胚胎质量的影响。方法用控制性超促排卵进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗60例因输卵管因素不孕病人,在取卵时留取第一管清亮卵泡液,分别用酶联免疫吸附试验法(ELISA)和酶免疫分析......


  [摘要]目的 探讨超促排卵周期取卵日(OPU)卵泡液中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及性激素水平对卵泡发育、卵子受精、卵裂及胚胎质量的影响。方法用控制性超促排卵进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗60例因输卵管因素不孕病人,在取卵时留取第一管清亮卵泡液,分别用酶联免疫吸附试验法(ELISA)和酶免疫分析法(EIA)测定60例卵泡液中GM-CSF浓度和促黄体生成素(LH)、孕酮(P)和雌二醇(E2)的含量,卵泡液按相应卵母细胞的成熟度、受精情况、卵裂和胚胎质量分组分析。 结果成熟卵泡组卵泡液中GM-CSF、LH和P水平均高于未成熟组( t=2.35~5.05,P <0.05),受精组卵泡液中GM-CSF、LH、P水平均高于未受精组( t=2.36~4.01,P <0.05);卵裂组与未卵裂组、高质量胚胎组与低质量胚胎组卵泡液中GM-CSF、P和LH水平无显著性差异(t=0.97~1.64,P >0.05);妊娠组GM-CSF和LH浓度高于未妊娠组( t=25.83、2.36,P <0.05),而孕酮含量无显著性差异( t=1,68,P >0.05);雌二醇浓度在各组间无明显差异( t=0.03~0.70,P >0.05)。卵泡液GM-CSF与E2水平呈正相关( r=0.321,P <0.01),与P和LH水平无相关性( r=0.145、0.147,P >0.05)。结论 OPU卵泡液中GM-CSF和LH浓度与相应卵泡的卵母细胞成熟及其后的受精有关,而与卵裂及胚胎质量无关,卵泡液中适量黄体生成素和P促进卵母细胞的成熟。卵泡液中GM-CSF与E2有相关性,提示E2对卵泡液中的GM-CSF水平有调节作用。
  
  [关键词]卵泡液;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;性激素类;卵泡;受精;胚胎

  EFFECTS OF GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR AND SEX HORMONE ON DEVELOPMENT   OF OVARIAN FOLLICLES AND EMBRYOGENESIS IN EARLIER PERIOD 

  ZHAI XIANG-HONG, MENG KE 

  (Department of Gynecology, Linyi Medical School, Linyi 276002,China)  

  [ABSTRACT]Objective  To investigate the influence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and   the sex hormone in the follicular fluid (FF) on the day of ovum pick-up (OPU)during controlled ovarian hyper-stimulation (COH) cycles on follicle development, fertilization, cleavage, and the quality of embryo.   Methods  Sixty women with tubal infertility  were treated with IVF-ET under controlled hyper-stimulation with GnRHa/FSH/HMG/HCG. The first tube of FF was kept while  collecting oocytes. GM-CSF in the FF and serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and estradiol(E2), progesterone (P) and luteinizint hormone (LH)concentrations measured by an enzyme immunoassay (EIA). The maturity  and fertilization of the oocytes were observed,and ultrasonography was performed to confirm clinical pregnancies four weeks after  the embryo transfer.   Results  In mature-oocyte group, its FF contained higher levels of GM-CSF,P,and LH than those in the immature-oocyte group ( t=2.35-5.05,P <0.05); in fertilized group, the levels of GM-CSF,P,and LH in FF were obviously  higher than those in non-fertilized ( t=2.36-4.01, P <0.05); no significant differences were seen in terms of GM-CSF, P, and   LH between the cleavage and non-cleavage group, as well as the high- and low-embryo grade group ( t=0.97-1.64,P >0.05).  GM-CSF and LH in pregnant group were higher than non-pregnant ( t=25.83, 2.36; P <0.05),but no difference was found in P   ( t=1.68, P >0.05). Estradiol concentrations in the FF showed no significant differences among the groups ( t=0.03-0.70,P >  0.05). GM-CSF was positively correlated to E    2    ( r=0.321, P <0.01),but not to P and LH ( r=0.145,0.147;P >0.05). Con-clusion  The levels of GM-CSF and LH in FF on OPU are related to the corresponding maturation of the oocyte and the then fertili-zation, and not related to cleavage and the quality of embryo. Adequate LH and P promote oocyte maturation. The correlation be-tween GM-CSF and E2 in FF indicates that E2regulates the level of GM-CSF in FF.  

  [KEY WORDS]follicular fluid; granulocyte macrophage colony-stimulating factor; sex hormone; ovarian follicle; fertiliza-tion; embryo     

  女性正常生殖功能依赖于下丘脑-垂体-卵巢轴  的相互作用,其中性甾体激素和促性腺激素释放激素(GnRH)多年来一直被认为是主要的调节因子,通过反馈作用调节下丘脑-垂体-卵巢轴的功能。而随着生殖医学的进展和辅助生殖技术的逐步普及,特别是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术的日新月异,卵巢内调节卵泡发育的细胞因子的作用日益受到重视,它们从免疫的角度影响生殖活动的各个环节,调节卵细胞发育、成熟、排卵等卵巢功能以及受精、着床、妊娠过程。本研究旨在通过对超促排卵周期取卵日(OPU)卵泡液中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度的测定,并与性激素水平相结合对比分析,以评价GM-CSF及性激素对卵泡发育成熟、受精、卵裂及胚胎质量的影响。   

  1 对象和方法   

  1.1 研究对象  

  2002年9月~2004年9月,选取因输卵管因素在临沂市人民医院生殖中心行IVF-ET治疗的不孕女性病人60例,入选标准为不孕史>2年,年龄     25~ 35岁,平均31.2岁,月经规律,基础激素水平无异常,均经子宫输卵管造影、腹腔镜及男方精液检查证实。所有病人均知情同意。   

  1.2 研究方法  

  1.2.1  控制性超排卵及标本采集

  所有病人IVF周期都应用标准的垂体降调节长周期促排卵方案,  达菲林1.25mg肌肉注射进行垂体降调节,经测定血清雌二醇(E2)浓度小于50 ng/L、超声观察卵巢无卵泡发育及子宫内膜厚度<5 mm为达到降调节  标准。每日肌肉注射重组FSH(瑞士Serono公司)150~375 U,当至少有3个以上卵泡直径>17 mm 时给予hCG 10 000 U肌肉注射。35~36 h后行阴  道超声指引下取卵术。卵泡入选标准:①所有卵泡  直径均大于16 mm;②卵泡液无血染;③1个卵泡内含1个卵母细胞,空卵泡除外。收取第1管清亮无  血染卵泡液,离心15 min后取上清,分装,-20 ℃冻存待测。  

  1.2.2  分组

  60例超促排卵周期卵泡液中,在卵母细胞-放射冠-卵丘复合物(OCCC)标记培养后,获成熟卵母细胞42例,未成熟卵母细胞15例,3例卵  母细胞老化。OCCC继续培养加入经处理的丈夫精液,检查原核确认受精,正常受精43例,未受精12例,其中5例异常受精。继续培养观察卵裂,已卵裂38例,未卵裂17例。对卵裂到4~8个细胞时的胚胎进行质量评分,共获高质量胚胎25例,低质量胚胎13例。得到的25个高质量胚胎被移植后4周阴道超声观察宫腔内是否存在孕囊,结果妊娠9例,未妊娠16例。   

  1.3 GM-CSF的检测  

  采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA),GM-CSF试剂盒购自美国Perry Laboratory公司。   

  1.4 性激素测定  

  试剂盒购自德国Serono公司,结果由DR1系  统自动计算得出。    

  1.5 统计学处理  

  数据用SPSS 10.0统计软件进行处理。各测量  指标的数据用 x±s表示,显著性比较采用t 检验及Spearman排序相关分析。   

  2 结  果  

  成熟卵泡组卵泡液中GM-CSF、促黄体生成素  (LH)和孕酮(P)水平均高于未成熟组( t=2.35~5.05 ,P <0.05);受精组卵泡液中GM-CSF、LH、P  浓度均高于未受精组( t=2.36~4.01,P <0.05);  卵裂组与未卵裂组,高质量胚胎组与低质量胚胎组  卵泡液中GM-CSF、P和LH平均浓度无显著性差  异( t=0.97~1.64,P >0.05);妊娠组GM-CSF和  LH浓度高于未妊娠组( t=25.83、2.36,P <0.05 ),而孕酮含量无显著性差异( t=1.68,P >0.05 );雌  二醇浓度在各组间均无差异( t=0.03~0.70 ,P >0.05 )。卵泡液GM-CSF与E2水平呈正相关( r=0.321,P <0.01 ),与P和LH水平无相关性( r=0.145 、0.147,P > 0.05 )。见表1。表1 卵泡液中GM-CSF、E2、P、LH水平与卵母细胞成熟、受精、卵裂、妊娠的关系(略)

  3 讨  论  

  IVF-ET成功的一个主要决定因素是产生多个成熟卵泡,卵母细胞受精,并获得健康的胚胎。卵泡的生长过程需众多激素和生长因子的调节,它们以自分泌或旁分泌的方式发挥生物效应    [1]    。   

  3.1 GM-CSF对卵泡发育、受精、卵裂及胚胎质量的影响

  GM-CSF是由活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞产生并  分泌的一种酸性糖蛋白,是生长因子家族成员之一,除了对造血细胞的作用外,已证实GM-CSF在人类  的血管内皮细胞、胎儿组织、膀胱肿瘤细胞和胎盘等组织中也起作用[2]。TAMURA等[3]的实验表明,大鼠卵巢巨噬细胞、肥大细胞和膜-间质细胞等在卵巢周期中均能合成并释放GM-CSF,在卵泡发育阶  段,GM-CSF的分泌增加,它主要在膜-间质细胞,特别是卵巢血管周围的细胞中表达[4]。说明GM-CSF  在卵巢局部参与了卵泡发育的调控,但GM-CSF在卵巢内是如何参与卵泡发育调控及激素合成的尚不清楚。研究显示,GM-CSF可直接通过对卵子或卵  泡细胞的作用,或通过募集巨噬细胞到卵巢,参与卵泡的发育和排卵过程。另有研究表明,卵泡液中含有大量的巨噬细胞,而巨噬细胞是产生GM-CSF的主要功能细胞[5],所以卵泡液中含有高水平的GM-  CSF。本研究结果显示,OPU获取的60例卵泡液中均测到GM-CSF,而且卵泡成熟组卵泡液中GM-CSF浓度高于未成熟组,受精组高于未受精组,妊娠组高于非妊娠组,提示OPU卵泡液中GM-CSF与卵母细胞成熟、受精和受精后发育潜能有关,可作为预测IVF结局的一项测量指标。   

  3.2 性激素对卵泡发育、受精、卵裂及胚胎质量的影响  

  在卵泡的发育过程中,垂体促性腺激素起到至关重要的作用。有研究结果显示,促性腺激素能诱导c-fos、c-myc、c-myb、c-erbB-2等癌基因的表达而调控颗粒细胞的分化和甾体激素分泌功能[6];能通过CAMP途径促进颗粒细胞增生,卵丘细胞膨散。而卵泡液中的甾体激素(雌激素、孕激素、雄激素)是垂体促性腺激素控制下由颗粒细胞和卵泡膜细胞分  泌,为卵泡和卵母细胞发育提供至关重要的激素微环境[7]。但对于COH周期卵泡液中激素浓度与卵母细胞成熟、受精、卵裂及IVF妊娠结局的关系,目前有以下观点。FIRMIN等[8]认为卵泡液中高浓度的P使颗粒细胞和卵母细胞功能上更成熟,可预测受精、妊娠;ENIEN等[9]认为卵泡液中E2浓度与颗粒细胞增生更相关,与卵母细胞成熟无关;而ASURAY等[10]则认为卵泡液中P、P/E2升高与妊娠相关,E2水平不能预测妊娠结局;FRANCHIMON等[11]发现在妊娠组卵泡液中P水平显著低于未妊娠组。上述观点的不同可能与用药方案及卵泡液来自单卵泡或多个卵泡有关。我们采用垂体降调节长周期方案促排卵,对单个卵泡的卵泡液进行研究,结果显示,卵泡液中P和LH浓度在成熟组显著高于未成熟组,正常受精组显著高于未受精组。提示OPU卵泡液中P和LH水平与卵母细胞的成熟和受精  有关;同时本研究还显示,卵泡液中LH水平妊娠组高于未妊娠组,这可能与LH能提高卵母细胞胞质的成熟有关。本文结果提示,OPU卵泡液中适量的LH和P含量促进了卵母细胞的成熟,LH水平与妊娠结局有关。   

  3.3 GM-CSF与性激素的相关性  

  GM-CSF在不同组织中均可直接或通过刺激巨噬细胞产生和释放其他细胞因子,间接诱导细胞增殖、分化。E2 是调节GM-CSF表达的重要递质。  性激素能调节子宫内膜和内膜间质细胞、子宫内巨噬细胞、末梢单核细胞、骨髓以及一些肿瘤细胞中GM-CSF及受体的表达。本文结果显示,卵泡液中  GM-CSF与E2水平呈正相关,提示E2对卵泡液中的GM-CSF水平也有调节作用,但调节GM-CSF表达的机制有待进一步研究。以上资料显示,COH周期OPU卵泡液中适量的LH和P促进卵母细胞的成熟,GM-CSF和LH浓度与相应卵泡的卵母细胞成熟及其后的受精有关,而与卵裂及胚胎质量无关。卵泡液中E2对GM-CSF水平有调节作用,卵泡液中LH和P促进卵母细胞的成熟。结果提示在卵泡晚期一定量的LH对受精和妊娠有利,可考虑IVF促排卵方案上,在卵泡募集阶段使用FSH,后期改用HMG促排卵,以降低IVF周期费用和提高周期妊娠率。   

  [参考文献]   

  [1] CHA K Y,CHAIN R C. Maturation in vitro of immature hu-  man oocytes for clinical use[J]. Reprod Update, 1998,4:103-  120. 

  [2] 陈勇,夏国良,苏友强. 体外培养条件下促性腺激素对昆明小  白鼠卵母细胞成熟及卵丘扩展的影响[J]. 动物学报,2001,47  (2):203-208.  

  [3]TAMURA K,TAMURA H,KUMASAKA K,et al. Ovari-an immune cells express granulocyte-macrophage colony-simu-lating factor (GM-CSF) during follicular lrowth and luteiniza-tion in gonadotropim-primed immature rodents[J]. Mol Cell Endocrinol, 1998,142:153-163.  

  [4]JOANNE S R, DARRYL L R, REBECCA L R, et al. Mole- cular mechanism of ovulation and luteinization[J]. Mol Cellu-  lar Immunol,1998,145: 47-54.  

  [5] MENEZO Y. LH and gamete quality[J]. J Gynecol Obstet     Biol Reprod, 2002,31:1S2-1S4.    

  [6] 郑月慧,钟志胜,方廉. c-fos、c-myb、c-erbB-2与大鼠卵巢颗粒  细胞生成孕酮调控关系的研究[J]. 中国应用生理学杂志,    2000,16(3):268-270.
     
  [7] 王一飞.  生殖医学[M]. 北京:人民卫生出版社, 1991:37.
      
  [8] FIRMIN C,AUTOINE J M, M ILLOT F,et al. Comparison   of plasma and follicular fluid horm one profiles following sti-mulation human menopausal gonadotropin,with or without LHRH agonists,for in vitro fertilization[J]. Hum Reprod,1991,6(5):653-658.  

  [9] ENIEN W M,SAHWY S E, HARRIS C P,et al. Human chorionic gonadotrophin and steroid concentrations in follicular    fluid: the relationship to oocyte maturity and fertilization rates   in stimulated and natural in vitro fertilization cycles[J]. Hum Reprod,1995,10(12):2840-2844.  

  [10] BASURAY R,SACHDEVA S,RAWLING R, et al. High   progesterone/estradiol ratio in follicular fluid at oocyte aspira-tion for in vitro fertilization as a predictor of possible pregnan-cy[J]. Fertil Steril,1988,49(6):1007-1011.  

  [11] FRANCHIMON T P,FRYDMAN R,HAZEE M T,et al.   Correlation between follicularfluid concent and the results of in vitro fertilization and embryo transfer. l sex steroids[J]. Fer-til Steril,1989,52(6):1006-1011.

  (山东省临沂卫生学校妇产科教研室,山东 临沂 276000)   


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