血小板膜糖蛋白Ⅰa C807T基因多态性与脑梗死急性期血小板功能的关系
［摘要］ 目的 探讨血小板膜糖蛋白（GP）Ⅰa C807T基因多态性与脑梗死急性期血小板功能的关系。方法应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法，检测147例脑梗死病人及120名正常对照者（对照组）的GPⅠa C807T基因型。体外应用Ⅰ型胶原诱导，比浊法检测血小板聚集。采用流式细胞仪测定外周血活化血小板分子标记物颗粒蛋......
［摘要］ 目的 探讨血小板膜糖蛋白（GP）Ⅰa C807T基因多态性与脑梗死急性期血小板功能的关系。方法应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法，检测147例脑梗死病人及120名正常对照者（对照组）的GPⅠa C807T基因型；体外应用Ⅰ型胶原诱导，比浊法检测血小板聚集；采用流式细胞仪测定外周血活化血小板分子标记物颗粒蛋白（GMP）CD62p、CD63表达。结果 脑梗死组GPⅠa T等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=3.85，P<0.05）。对照组与脑梗死组T等位基因携带者加入胶原90 s时血小板聚集率较CC基因型者显著增高（t=7.4~9.9, P<0.05），而两者最大血小板聚集率无显著性差异（t=1.19~1.30, P>0.05）。脑梗死组T等位基因携带者CD62p、CD63阳性率明显高于CC基因型者（t=10.3~17.8，P<0.05）。结论 血小板膜GPⅠa T807等位基因可能是脑梗死的遗传危险因素，血小板功能增强可能是T等位基因促进脑梗死发病的机制之一。
［关键词］ 血小板糖蛋白ⅠaⅡa；基因多态性；脑血管障碍
ASSOCIATION OF PLATELET GLYCOPROTEIN Ⅰa C807T GENE POLYMORPHISM WITH PLATELET FUNCTION IN ACUTE CEREBRAL INFARCTION
YANG XUEWEI, HUANG JIN, ZHOU CHANG
(Institute of Cerebrovascular Diseases, Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the association of the platelet glycoprotein Ⅰa C807T gene polymorphism and the function of platelet in acute cerebral infarction.MethodsBy PCRrestriction fragment length polymorphism technique, the platelet glycoprotein Ⅰa C807T genotypes were detected in 147 patients with cerebral infarction and 60 healthy controls. Collagen typeⅠinduced platelet aggregation was measured by turbidimetry. A marker of activated platelet CD62p and CD63 was measured by whole blood flow cytometry. ResultsThe frequencies of GPⅠa T allele were significantly higher in the infarction group than in the control one (χ2=3.85,P<0.05). Collagen typeⅠinduced platelet aggregation was significantly higher in the individuals with GPⅠa T allele than in those with CC genotype (t=7.4-9.9, P<0.05）, but no significant difference was found in the maximal platelet aggregation between them (t=1.19-1.30, P>0.05). The expression of CD62p and CD63 was significantly higher in the cerebralinfarction group with T allele than in CC genotype (t= 10.3-17.8, P<0.05). ConclusionThe platelet collagen receptor GPⅠaⅡa T807 allele might be an independent risk factor in the development of cerebral infarction. Enhanced platelet function might be one of the mechanisms of T allele in the pathogenesis of cerebral infarction.
［KEY WORDS］platelet glycoprotein ⅠaⅡa；genetic polymorphism；cerebrovascular disorders
血小板膜糖蛋白(GP)ⅠaⅡa是血小板主要的胶原受体，属整合素家族，由α和β两
亚单位组成，亦称α2β1整合素。通过GPⅠaⅡa，血小板黏附到血管内皮下暴露的胶原上，随之被活化［1］。近年来，在GPⅠa基因转录区807（C或T）和873（G或A）发现两种多态性［2］，且807T和873A完全连锁。随之发现
些多态性不能改变GPⅠa的氨基酸序列，即GP的受体功能不受影响，但多态性和GPⅠaⅡa在血小板表面的表达水平明显相关［3］。病例对照研究显示, GPⅠa T807等位基因可能是脑梗死的遗传易感因素。
关于GPⅠa C807T基因多态性与脑梗死急性期血小板功能的关系，国内未见报道。我们检测了脑梗死急性期病人GPⅠa基因多态性、血小板聚集、CD62p和CD63表达，探讨该基因多态性在脑梗死发病中的作用机制。
1 对象与方法
1.1 对象
1.1.1 实验组 选择脑梗死病人147例，均为发病24 h内的病人，符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准。全部病例均经CT或MRI证实。男81例，女66例；年龄41～76岁，平均（64.7±19.0）岁。
1.1.2 对照组 120例，为我院门诊健康体检者。经询问病史、体检、实验室检查及心电图检查，排除脑血管疾病、心肌梗死及肝、肾疾病者。男62例，女58例；年龄40～75岁，平均（59.4±17.6）岁。两组在年龄、性别构成、血脂水平及吸烟量方面经统计学处理无显著性差异。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 取外周静脉血3 mL, 20 g/L EDTA抗凝。
1.2.2 活化血小板分子标记物颗粒蛋白（GMP）CD62p、CD63表达的检测 采用Calibur型流式细胞仪。
1.2.3 体外Ⅰ型胶原诱导的90 s血小板聚集和最大聚集率检测 采用比蚀法测定。
1.2.4 GPⅠa C807T基因多态性的检测 应用Sangon UNIQ10柱式临床样品基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。目的片断的扩增参照REINER等［4］方法设计一对引物，正义寡核苷酸5′GTGTTTAACTTGAACACATAT3′，反义寡核苷酸5′ACCTTGCATATTGAATTGCTT3′。总反应体积为50 μL，内含：10×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL, 10 mmol/L dNTP 1 μL, 10 mmol/L的引物5 μL, TaqDNA聚合酶2 U，模板2 μL。PCR扩增仪扩增，条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。取PCR产物10 μL，加入TaqⅠ酶5 U，65 ℃水浴1 h。酶切产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，以PCR Marker作参照，紫外线灯下观察扩增结果。产物长度为115 bp者称为TT型，产物长度为92 bp者称为CC型，若有两种带型，则为CT型。
1.2.5 统计方法 应用SPSS统计软件进行统计学处理。计量资料组间比较用t检验，计数资料组间比较用χ2检验。
2 结果
2.1 两组GPⅠa基因型及等位基因频率分布
实验组GPⅠa T等位基因携带者频率与对照组相比差异有显著性（χ2=3.85，P<0.05），见表1。
2.2 两组GPⅠa基因多态性与血小板聚集率关系
对照组与实验组T等位基因携带者加入胶原90 s时血小板聚集率较非T等位基因携带者显著增高(t=7.4~9.9，P<0.05），而两者最大血小板聚集率无显著性差异（t=1.19~1.30, P>0.05）。实验组与对照组比较，加入胶原90 s时T等位基因和非T等位基因携带者血小板聚集率均明显增高（t=18.3~18.6，P<0.01）。见表2。
2.3 两组GPⅠa基因多态性与CD62p、CD63表达量的关系
实验组T等位基因携带者CD62p、CD63阳性率明显高于非T等位基因携带者（t=10.3~17.8，P<0.05）;对照组GMP阳性率在T等位基因携带者和非T等位基因携带者之间均无显著性差异（t=0.78~1.85，P>0.05）。实验组与对照组相比，同基因型之间CD62p、CD63阳性率均显著增高（t=5.74~57.80，P<0.01）。见表3。
表1 两组GPⅠa基因型及等位基因频率比较（略）
表2 两组GPⅠa基因多态性与血小板聚集率的关系（略）
表3 两组GPⅠa基因多态性与CD62p、CD63表达量的关系（略）
3 讨论
血小板GPⅠaⅡa是血小板主要的胶原受体，在血小板聚集和黏附中起主要作用，因此血小板GP密度的变异可能为血栓性疾病的危险因素。KUNICKI等［2］的研究显示, 血小板膜GPⅠaⅡa的密度在健康个体间相差4倍。又有研究发现，GPⅠa基因的多态性与血小板膜GPⅠaⅡa表达水平相关。携带T873／A807等位基因的个体，血小板表达高水平的GPⅠaⅡa，反之，CC基因型个体血小板表达低水平的GPⅠaⅡa。高水平的GPⅠaⅡa表达仅依赖于T807等位基因的存在，同纯合子TT相比，杂合子TC表达相似数量的GPⅠaⅡa［5］。随后又有实验证实，血小板同胶原的黏附率随GPⅠaⅡa密度的增大而增加，携带T等位基因的个体比CC基因型个体血小板聚集率快［6］。但GPⅠa基因多态性与脑梗死急性期血小板活化和血小板聚集的关系未见报道。
本文应用PCRRFLP技术分析了脑梗死病人血小板GPⅠa基因C807T多态性，结果表明，实验组携带T807等位基因的频率明显高于对照组，差异有统计学意义。CARLSSON等［7］研究发现，GPⅠa T807等位基因与年龄≤50岁的卒中病人呈明显相关性，其卒中危险性增加3.02倍，与本文的研究结果和既往研究结果一致［8］。
体外以Ⅰ型胶原诱导血小板聚集，实验组T等位基因携带者与CC基因型者相比较，加入诱导剂90 s时血小板聚集率显著增高, 但两者的最大血小板聚集率无显著性差异。这与KRITZIK等［3］研究结果一致。推测可能因CC基因型者血小板膜GPⅠaⅡa分子密度较低，仅能黏附较少量胶原，故促进血小板活化，进而启动血小板聚集较为缓慢，但随着活化血小板释放多种活性物质如血小板活化因子（PAF）等，可放大血小板对胶原的反应，从而导致最大血小板聚集率无显著性差异。
脑梗死病人，由于血管内皮损伤，内皮下胶原暴露，使血液中的血小板被激活，而导致存在于血小板内的α颗粒膜上的GMP140即CD62p迅速与血小板质膜融合转移至膜表面；同时血小板内的溶酶体蛋白CD63已在血小板活化时随脱粒反应而表达在血小板膜表面，因此，此2种蛋白已成为识别活化血小板的分子标志物［8］。本文研究结果显示，实验组T等位基因携带者CD62p、CD63阳性率显著高于CC基因型者，实验组血浆CD62p、CD63阳性率显著高于同基因型的正常对照组，表明T等位基因携带者血小板活化程度明显增高。
由本研究结果推测，T807等位基因携带者因血小板表达高密度的血小板膜GPⅠaⅡa分子，迅速黏附大量胶原，引起血小板活化明显增加，诱导血小板聚集功能迅速启动，在此基础上形成血小板血栓。
由于本文病例对照研究的病例数较少，我们得出的结论还需要大规模的前瞻性研究证实，从而可以根据GPⅠa C807T基因多态性对人群进行危险分层，为是否需要进行抗血小板治疗提供理论依据。
［参考文献］
［1］SANTORO S A, ZUTTER M M. The α2β1 integrin: a collagen receptor on platelets and other cells［J］. Thromb Hsemost, 1995,74(3):813.
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［3］KRITZIK M, SAVAGE B, NUGENT D J, et al. Nucleotide polymorphisms in the α2 gene define multiple alleles that are associated with difference in platelet α2β1 density［J］. Blood, 1998,92(7):2382.
［4］REINER A P, KAELEN M, GAYLE T, et al. Analysis of platelet glycoprotein Ⅰa (α2 Integrin) allele frequencies in three north american populations reveals genetic association between nucleotide 807 C/T and amino 505 Glu/Lys(HPA5) dimorphisms［J］. Thromb Haemost, 1998,80(3):449.
［5］阮长耿. 血小板基础与临床研究进展［J］.生物学通报, 2002, 37(4):1.
［6］KUNICKI T J, ORCKEKOWSKI R, ANNIS D, et al. Viariability of integrin alpha2 beta1 activity on human platelets［J］.Blood, 1993,82(9):2693.
［7］CARLSSON L E, SENTOSO S, SPITZER C, et al. The α2 gene coding sequence T807/A873 of the platelet collagen receptor integrin α2β1 might be a genetic risk factor for the development of stroke in younger patients［J］. Blood, 1999, 93(11):3583.
［8］周畅，金丽英，杨学伟, 等.缺血性脑卒中与血小板膜糖蛋白Ⅰa 基因转录区寡肽807多态性的关系［J］.齐鲁医学杂志， 2004,19(1):22.
（本文编辑 黄建乡）
［作者简介］杨学伟（1954），女，实验师。
（青岛大学医学院脑血管病研究所, 山东 青岛 266003； 日照港口医院脑外科）
发布日期：2006-12-20
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