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小鼠肠干细胞群对外源性草酸耐受性的研究

来源:《现代泌尿外科杂志》 作者:刘冠琳,叶章群,陈志强,余 虓,郭 辉,蔡 丹 2008-12-27
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摘要: 【摘要】 目的 探索利用体外细胞培养技术构建的小鼠肠干细胞群对外源性草酸的耐受能力。方法 利用细胞体外原代培养技术分离并培养小鼠肠干细胞群,将获得的细胞群种植于24孔板中。选取8孔生长状态较好的细胞,分别加入含终浓度为40、35、30、25、20、15、10、5mmol/L草酸钠的细胞培养液,置入CO2恒温培养箱内培养......


【摘要】  目的 探索利用体外细胞培养技术构建的小鼠肠干细胞群对外源性草酸的耐受能力。方法 利用细胞体外原代培养技术分离并培养小鼠肠干细胞群,将获得的细胞群种植于24孔板中;选取8孔生长状态较好的细胞,分别加入含终浓度为40、35、30、25、20、15、10、5mmol/L草酸钠的细胞培养液,置入CO2恒温培养箱内培养72h后观察细胞状态。结果 经反复实验可见草酸钠浓度为25mmol/L的孔中,细胞生长速度减慢,出现少许空泡样改变;而浓度大于或等于30mmol/L孔中,细胞出现大量空泡样改变,甚至崩解、死亡;草酸钠浓度小于或等于20mmol/L的孔中细胞没有出现异常,生长状态较好。结论 培养基中草酸浓度小于或等于20mmol/L时,小鼠肠干细胞群能正常生长分化。

【关键词】  肠干细胞;草酸钠;空泡


   泌尿系结石是一个全球性的疾病,人群患病率约1%-5%。草酸钙结石的发病率约占泌尿系结石总发病率的60%-80%,而特发性草酸钙结石患者可占草酸钙结石症全部病例数的80%以上。草酸钙肾结石的成石因素包括高草酸尿、高钙尿、低尿量、低枸橼酸尿、高尿酸尿及成石抑制物缺乏等,其中最重要的成石原因为高草酸尿。而草酸在消化道吸收异常增多是特发性高草酸尿形成的重要因素[12]。肠干细胞是一种位于肠隐窝底部的成体干细胞,它在理论上具有无尽的增殖和分化功能[34]。研究体外水平肠干细胞群对外源性草酸的耐受能力,对进一步研究肠损伤以及一些代谢性疾病(如特发性草酸钙结石)有着重要的意义。

    1  材料与方法

    1.1  小鼠肠干细胞群的分离培养

    1.1.1  主要试剂的配制方法  细胞培养液的配制方法:DMEM培养基中加入10%的新生牛血清(购自GIBYCO公司)。除此以外,培养液中还含有以下成分:表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)20ng/mL,胰岛素2μg/mL,谷氨酰胺2mmol/mL,青霉素及链霉素各100u/mL。

    本次实验中,肠干细胞群的分离采用酶消化法。所用的酶消化液含有两种成分:透明质酸酶(购自Sigma公司,应用液浓度为100u/mL),Ⅺ型胶原酶(购自Sigma公司,应用液浓度为300u/mL)。

    细胞清洗液采用含有50mL/L新生牛血清的DMEM培养液,加入青霉素及链霉素,使其浓度均达到200u/mL。

    草酸钠储备液配制方法:取2.7g草酸钠溶于100mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中,过滤除菌后分装备用。

    1.1.2  肠干细胞群的分离和培养  取孕17d昆明系小白鼠,断颈法处死后打开胎盘取出胚胎鼠肠组织,采用酶消化法分离细胞(37℃,20min),种植于24孔细胞培养板中(购自Corning公司),放置在5%二氧化碳培养箱内培养。48h后进行第一次换液,以后每72h换液1次。连续观察、记录细胞生长情况。

    1.1.3  肠干细胞群的鉴定  获得的原代细胞传5代后(约25d),将细胞转至事先装有盖玻片的24孔板中,行细胞爬片,每72h换液一次。7d后,固定细胞(固定液由丙酮和无水乙醇按1∶1配制)。将细胞爬片利用角蛋白18亚型抗体(购自Sigma公司)行免疫组织化学染色,以鉴定细胞的组织来源。

    1.2  细胞培养液草酸浓度的测定  采用离子色谱法反复测量细胞培养液中草酸浓度。

    1.3  筛选肠干细胞群所能耐受的外源性草酸浓度  选取8孔生长状态较好的细胞,分别加入经过滤除菌后的草酸钠储备液(27g/L)200、175、150、125、100、75、50、25μL后,每孔用细胞培养液补齐至1mL,使每孔中草酸钠浓度分别为40、35、30、25、20、15、10、5mmol/L。置入CO2恒温培养箱内培养72h后观察细胞状态。

    2  结    果

    2.1  肠干细胞群的分离和培养结果  细胞种植3h后,显微镜下就可见有细胞开始贴壁生长,48h后,细胞贴壁基本完成。显微镜下可见,上皮样细胞呈集落状生长,主要有三种克隆:典型上皮构成的克隆,约占30%;扁平上皮细胞构成的克隆,约占20%;两种细胞混合生长的克隆,约占50%(图1)。培养出的肠干细胞群在第3、4代达到生长分化的顶峰;而后干细胞

    图1  培养48h的肠干细胞群镜下可见上皮样细胞呈集落状生长,其中,由典型上皮构成的克隆约占30%(A),由扁平上皮细胞构成的克隆约占20%(B),混合生长的克隆约占50%

    逐渐减少,成熟的肠上皮细胞逐渐增多。经1个多月的培养,传至第7-8代,肠干细胞群开始凋亡。上皮细胞在传代生长的过程中,细胞形态逐渐改变,有些细胞在形态上类似于成纤维细胞等间质细胞,但角蛋白18亚型抗体染色为阳性,确认其为肠干细胞群(图2)。

    2.2  细胞培养液中草酸浓度  经反复测量,细胞培养液中草酸浓度为零。

    2.3.1  肠干细胞群对外源性草酸的耐受状况  经多次重复实验可见,草酸钠浓度为25mmol/L的孔中,细胞生长速度减慢,出现少许空泡样改变;而浓度大于或等于30mmol/L孔中,细胞出现大量空泡样改变,甚至崩解、死亡(图3);草酸钠浓度小于或等于20mmol/L(2.7g/L)的孔中,细胞没有出现异常,生长状态较好。

    图3  肠干细胞群对草酸的耐受草酸钠浓度为25mmol/L的孔中,细胞生长速度减慢,出现少许空泡样改变(A);而浓度大于或等于30mmol/L孔中,细胞出现大量空泡样改变,甚至崩解、死亡(B)

    3  讨    论

    草酸是人体不能代谢的终产物,根据其来源分为内源性草酸和外源性草酸,外源性草酸的吸收是尿草酸的主要来源[56]。外源性草酸主要在肠道吸收。位于肠道隐窝部位的肠干细胞保持着旺盛的增殖分化能力。凋亡脱落及受损坏死的细胞与干细胞增殖、分化之间保持着动态平衡。探索外源性草酸的吸收对肠干细胞生长分化功能的影响,对进一步研究肠损伤和某些代谢性疾病(如特发性草酸钙结石)有着重要的意义。本实验通过在体外水平构建肠干细胞群吸收外源性草酸的模型,初步研究了肠干细胞群对外源性草酸的耐受能力。

    3.1  肠干细胞群的鉴定  目前,肠道干细胞生物学研究仍存在一个缺憾,即还没有一种得到公认的、能用于分离和培养肠干细胞的特异性标志物。一般认为,肠干细胞所在克隆特异性表达18亚型角蛋白[5]。本实验通过细胞形态学、功能状况以及免疫组织化学方法3个方面综合进行细胞鉴定。如前所述,本实验所培养出的细胞就形态学而言,已出现与国外文献报道基本符合的三种细胞克隆。就功能而言,细胞能存活1个月以上,且至少能传7、8代。这间接说明细胞群中必然含有大量的干细胞。传代的细胞虽然在形态上发生了一些改变(其机制有待进一步研究),但是将传代后的细胞进行细胞爬片,行免疫组织化学染色,角蛋白18亚型抗体染色为阳性,说明细胞的组织学来源没有错误。

    3.2  肠干细胞群对外源性草酸耐受性研究  本研究发现,正常细胞培养液中,草酸浓度基本上为零。我们通过在细胞培养液中加入外源性草酸,在体外水平构建了一个肠干细胞群接触、吸收草酸的模型。通过改变培养基中草酸钠的浓度,经反复实验可以看到,当草酸浓度小于2.7g/L时,小鼠肠干细胞群能正常生长分化;而当草酸浓度大于或等于2.7g/L,肠干细胞群在体外就难以正常生长分化,甚至难以存活。可以认为,较低浓度的草酸(<2.7g/L)对肠干细胞群并无不良影响;草酸局部浓度过高则是肠道的一种损伤因素。

    在体内,肠干细胞的生长分化以及凋亡受到多种因素的影响。草酸作为机体代谢的终产物,对肠干细胞的生长分化以及凋亡是否有影响,国内外尚无文献报道。本研究通过体外水平构建肠干细胞群接触、吸收草酸的模型,首次发现草酸局部浓度过高是肠道的一种损伤因素,并通过筛选,找到了适宜肠干细胞群生长的局部草酸浓度,不仅对肠损伤的研究有着重要的意义,而且为将来进一步研究特发性草酸钙结石的基因治疗打下了良好的基础。

【参考文献】
  [1]叶章群. 泌尿系结石研究现状与展望 [J]. 中华实验外科杂志, 2005, 22(3):261262.

[2]陈志强,姚林方,叶章群. 特发性草酸钙结石研究现状 [J]. 临床泌尿外科杂志, 2005, 20(5):257260.

[3]Potten CS, Owen G, Hewitt D, et al. Stimulation and inhibition of proliferation in the small intestinal crypts of the mouse after in vivo administration of growth factor [J]. Gut, 1995, 36(6):864873.

[4]Slorach EM, Campbell FC, Dorin JR. A mouse model of intestinal stem cell function and regeneration [J]. Cell Sci, 1999, 112(Pt 18):30293038.

[5]Prennen JAC, Boer P, Dorhart Mess. Absorption kinetics of oxalate from oxalaterich food in man [J]. Amer Clin Nutr, 1984, 40(5):10071010.

[6]Jaeger P, Robertson WG. Role of dietary intake and intestinal absorption of oxalate in calcium stone formation [J]. Nephron Physiol, 2004, 98(2):6471.(编辑 刘 华)


作者单位:(华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科,武汉 430030)The tolerance of mouse intestinal stem cells to oxalate


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