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川芎嗪对大鼠腹膜粘连中TGF-β1表达的影响

来源:中国煤炭工业医学杂志 作者:郑进 赵魁 2007-12-19

摘要: 关键词 川芎嗪。腹膜粘连。转化生长因子-β1摘要 目的 探讨川芎嗪对大鼠腹膜粘连中TGF-β1表达的影响。方法 制作S-D大鼠腹膜粘连模型,关腹前注射川芎嗪注射液(约为50mg/kg)和生理盐水。...


  关键词  川芎嗪;腹膜粘连;转化生长因子-β1

  摘要  目的  探讨川芎嗪对大鼠腹膜粘连中TGF-β1表达的影响。方法  制作S-D大鼠腹膜粘连模型,关腹前注射川芎嗪注射液(约为50mg/kg)和生理盐水;术后7d行二次开腹手术,链霉亲和素免疫组化法(SA BC法)检测粘连组织中TGF-β1蛋白的表达,酶联免疫 (ELISA法)定量检测血液及腹水中TGF-β1的浓度。结果  川芎嗪组腹腔积液中的TGF-β1浓度(206.37±25.56ng/ml)明显低于模型组(293.42±29.61 ng/ml )和生理盐水组(287.46±30.55 ng/ml)(P<0.05)。粘连组织中染色强度和血液中的TGF-β1浓度值在模型组(244.98±31.4 7ng/ml)、生理盐水组(258.14±26.38ng/ml)和川芎嗪组(251.79±27.42ng/ml)三组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论  川芎嗪抑制腹腔积液中TGF-β1的表达,但对粘连组织和血液中的TGF-β1含量无影响。

  THE EFFECTS OF LIGUSTRAZINE IN THE EXPRESSION OF TGF-β1 IN THE RATS WITH PERITONEAL ADHESIONS FORMATION 

  Zheng Jin,Zhao Kui.

  Key words  ligustrazine; peritoneal adhesion; transforming growth factor-beta

  Abstract  Objective  To investigate the role of Ligustrazine in the expression of TGF-β1 in rats with adhesion formation. Methods  The uniform defects on the peritoneal wall and cecal surface were developed to establish the rate adhesion model. Ligustrazine(50mg/kg)or  0.6 ml normal saline was instilled into the abdominal cavity. 7 days later,The immunohistochemical method and Enzyme-linked immunosorbent assay was used respectively to identify the volume of TGF-β1 in intraperitoneal adhesion tissue and the concentration in blood or in peritoneal fluid. Results  There was no significant difference in the staining density of TGF-β1 in intraperitoneal adhesion tissue  and the concentration of TGF-β1 in serum. But the concentration of TGF-β1 in peritoneal fluid was significantly lower in group L rats than in group M and group N (206.37±25.56ng/ml versus 293.42±29.61 ng/ml, 258.14±26.3 8 ng/ml; P<0.05). Conclusions  The Ligustrazine can reduce the expression of TGF-β1 in peritoneal fluid, but not influence on TGF-β1 in adhesion tissues or in blood.

    腹膜粘连是腹部术后常见的并发症,尽管随着外科技术和设备的发展,术后腹膜粘连问题有所减轻,但不能完全避免。川芎嗪(Ligusrazine)临床多用于心、脑血管疾病的治疗,近来发现其具有干扰腹膜粘连形成的作用[1],TGF-β1与术后腹膜粘连的形成有着密切关系[2,3],因此本实验通过腹腔内注射川芎嗪来观察其是否影响大鼠腹膜粘连时TGF-β1的表达,进一步探讨川芎嗪干预大鼠腹膜粘连的机制。

  1  材料与方法

  1.1  实验动物  选用健康S-D(Sprague Dawley)大鼠30只,鼠龄4~5个月,均为雌性,动物级别为清洁级,体重(250±20)g(由河北医科大学实验动物中心提供)。

  1.2  实验动物模型制备及分组  模型制作参照Harris等[4]介绍的方法并加以改进[3],关腹前用抽签的方法随机分成模型对照组(M)、注射生理盐水组(N)和注射川芎嗪组(L)三组,川芎嗪组关腹前将川芎嗪注射液0.6ml(约为50mg/kg)注于两创面和腹腔,盐水组则入0.6ml的生理盐水,模型组则直接关腹,各组动物均在术后7d再次在麻醉下腹腔内注入1ml生理盐水,再抽出灌洗后腹腔积液1ml,行二次开腹手术,切取粘连组织并剪开膈肌,暴露心脏,穿刺右心房,抽取静脉血2ml。

  1.3.2  链霉亲和素免疫组化法(SABC)检测粘连组织中TGF-β1  取三组动物粘连组织,置于10%的中性甲醛固定24h,常规石蜡包埋,5μm厚连续切片,切片常规脱蜡,下行水化。按SABC法做免疫组化检查。一抗为1:50兔抗TGF-β1抗体,二抗为生物素化山羊抗兔IgG。阴性对照由PBS替代一抗。实验中所用抗体、SA BC试剂盒均为武汉博士德公司产品,其余试剂为国产分析纯。将已证实的阳性片作对照,连续观察切片中5个高倍视野(×400),以细胞浆呈弥漫棕黄色细小颗粒为阳性细胞。

  1.3.4  血及腹腔积液TGF-β1的检测  静脉血2ml及腹腔积液1ml置于空白试管中,3000转/min离心15min后抽取血清及上清液200μl置于锥型试管中,立即置于-20℃冰箱保存待检。测定采用酶联免疫吸附法(ELISA),按说明书操作。TGF-β1试剂盒由深圳晶美实业有限公司提供。测定波长450nm。主要仪器有酶标扫描仪Bio-Rad2550型及洗板机Bio-Rad1575型。

  1.4  统计学方法  所有数据均以±s表示,采用单因素方差分析(one- way NAOVA)  ,两两比较用LSD检验,应用SPSS11.0统计软件处理。检验水准α=0.05。

  2  结果

  2.1  粘连组织中TGF-β1情况  链霉亲和素免疫组化法显示:TGF-β1定位表达粘连组织中的巨噬细胞中,棕黄色的阳性物质都沉积于巨噬细胞的胞浆中,三组之间染色强度差异无统计学意义。

  2.2  血液中的TGF-β1  ELISA法测定血液中的TGF-β1显示:模型组(244.98±31.47)ng/ml、生理盐水组(258.14±26.38)ng/ml和川芎嗪组(251.79±27.42)ng/ml三组之间的浓度值差异无统计学意义(F=0.53,P>0.05)见表1。

  表1  三组大鼠腹腔积液和血液中TGF-β1的浓度(略)

  2.3  腹水中的TGF-β1  ELISA法测定腹腔积液中的TGF-β1显示:三组浓度值比较差异有统计学意义(F=28.80,P<0.05),见表1。川芎嗪组浓度值(206.37±25.56)ng/ml明显低于模型组(293.42±29.61)ng/ml(q=3.51,P<0.05)和生理盐水组(287.46±30.55)ng/ml(q=3.41,P<0.05),差异有统计学意义。模型组和生理盐水组之间差异无统计学意义(q=0.05,P>0.05)。

  3  讨论

  粘连是腹膜对多种损害如创伤、炎症、异物等的普遍反应,仍然是腹部术后常见的并发症,目前,虽然预防腹膜粘连的方法很多,但达到理想效果的不多。川芎嗪(Ligustrazine)是中药川芎的有效成分之一,具有扩张血管;轻度降压;改善微循环;抑制血小板粘附聚集和血栓形成;抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增生;调节脂质代谢、抗脂质过氧化;调节免疫及钙拮抗等多种药理作用,临床多用于缺血性心、脑血管疾病的治疗,近来发现其具有干扰腹膜粘连形成的作用[1]。TGF-β为二聚体,二个亚单位相同,均有122个氨基酸。在哺乳动物中有三种类型即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,这三类的生物学特性基本相同,其中TGF-β1在组织损伤中效应最强。TGF-β对成纤维细胞和炎症细胞有趋化作用,并促进细胞的分化和增殖及血管形成,通过抑制基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases MMPs)的表达和促进金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases TIMPs)的表达,从而促进细胞外基质(ECM)的合成而抑制其降解,刺激结缔组织形成,另外还可以抑制许多上皮细胞包括受损腹膜间皮细胞的生长和增殖,这些均与术后腹膜粘连的形成有着密切关系[2,3]。在腹膜损伤处的粘连组织中TGF-β与未损伤腹膜组织中的相比较明显升高,且主要存在粘连组织中的巨噬细胞、成纤维细胞、小动脉内皮细胞及平滑肌细胞[5]。若腹腔内注射TGF-β则可使粘连加重[6],具有TGF-β1遗传基因的野生型小鼠腹水中TGF-β1浓度高,粘连程度重,而具有TGF-β1遗传基因突变型小鼠的情况则相反[7]。在体外用TGF-β处理人腹膜间皮细胞后,则细胞高表达纤维酶原激活抑制因子而低表达组织纤溶酶原激活因子[8],另外应用TGF-β抗体对粘连的形成有一定的影响[9]。这些均表明TGF-β在腹膜粘连中起着关键性的作用。本实验显示川芎嗪可以抑制腹腔积液中的TGF-β1表达,表明腹腔积液在腹膜损伤时中起关键作用, 可以通过影响腹水中TGF-β1表达来减少粘连的形成,而一旦粘连形成再去影响TGF-β1表达则作用不大,川芎嗪对血液中的TGF-β1的浓度无影响,说明血液中TGF-β1对粘连的形成作用不是主要的,亦可能是川芎嗪被吸收入血的量少。故今后的研究主要应探讨腹腔积液与腹膜粘连的关系。

  4  参考文献
 
  [1]  郑进, 赵魁. 川芎嗪对大鼠腹膜粘连及TNF-α表达的影响[J].中国现代医学杂志,2006,16(3):219-222
 
  [2]  Barnard JA,Lyons RM,Moses HL.The cell biology of transforming growth factor-β[J].Biophys Acta,1990,1032:79-87
 
  [3]  Massague J.The transforming growth factor-β family[J].Ann Rev Cell Biol,1990,6:597-641
 
  [4]  Harris ES,Morgan RF,Rodeheaver GT.Analysis of the kinetics of peritoneal adhesion formation in the rat and evaluation of potential antiadhesive agents[J].Surgery,1995,117:663-669
 
  [5]  Chegini N,Gold LI,Williams RS,et al.Location of transforming growth factor beta isoforms TGF-β1、TGF-β2 and TGF-β3 in surgically induced pelvic adhesions in the rat[J].Obstet Gynecol,1994,83:449-454
 
  [6]  Williams RS,Rossi AM,Chegini N,et al.Effect of transforming growth factor beta on postoperative adhesion formation and intact peritoneum[J].J Surg Res,1992,52:65-70
 
  [7]  Krause TJ,Katz D,Wheeler CJ,et al.Increased levels of surgical adhesions in TGF beta 1 hetweozygous mice[J].J Invest Surg,1999,12:31-38
 
  [8]  Ealk P,Ma C,Chegini N,et al.Differential regulation of mesothetial cell fibrinolysis by transforming growth factor beta 1[J].Scand J Clin Lab Invest,2000,60:439-447
 
  [9]  Lucas PA,Warejcka DJ,Young HE,et al.Formation of abdominal adhesion is inhibited by antibodies to transforming growth factor beta 1[J].J Surg Res,1996,65:135-138

  河北省唐山市工人医院肿瘤外科 


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