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单链抗体的研究进展

来源:中华现代中西医杂志 作者:朱国华,吴其标,黄宇烽 2006-8-20
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摘要: 【摘要】 特异性鼠单抗体具有异源性,应用于人体会引发人抗鼠抗体的毒性反应,并使抗体在体内消除加快。因此,应用于临床的理想抗体应是人源性的,但人-人杂交瘤技术目前尚未突破,且还存在人-人杂交瘤体外传代不稳定、抗体亲和力低及产量不高等问题。目前解决此问题的较好办法之一是研制基因工程抗体,代替鼠源单抗体应......


  【摘要】  特异性鼠单抗体具有异源性,应用于人体会引发人抗鼠抗体的毒性反应,并使抗体在体内消除加快。因此,应用于临床的理想抗体应是人源性的,但人-人杂交瘤技术目前尚未突破,且还存在人-人杂交瘤体外传代不稳定、抗体亲和力低及产量不高等问题。目前解决此问题的较好办法之一是研制基因工程抗体,代替鼠源单抗体应用于临床。本文仅对单链抗体的研究进展做一简要综述。

    【关键词】  单克隆抗体;可变区;基因工程抗体;单链抗体

     自1975年杂交瘤技术问世以来,单克隆抗体在医学中被广泛地应用于痢疾等疾病的诊断与治疗。但目前绝大多数单克隆抗体是鼠源性的,临床重复给药时人体内易产生抗鼠抗体,使其临床疗效减弱或消失[1]。如今解决此问题的较好办法之一是研制基因工程抗体以代替鼠源单克隆抗体应用于基础研究或临床治疗。基因工程抗体技术是在基因水平对Ig分子进行切割、拼接或修饰,甚至是人工全合成后导入受体细胞,从而表达出的新型抗体,也称为第三代抗体。基因工程抗体包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、单区抗体和抗体库等,本文仅对单链抗体的研究进展做一简要综述。

    1  单链抗体的概述

    单链抗体(single chain antibody,SCA或single chain Fv,ScFv)是一种新型重组蛋白,由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段15~25个氨基酸残基构成的弹性短肽(Linker)相连而成。单链抗体具有自身的一系列特点:(1)只含有抗体的V区,却能保持较完整的抗原结合位点;(2)缺乏Fc段,不与非靶细胞结合,有利于作为药物的导向载体,运用于临床;(3)免疫原性低;(4)分子量小,容易穿透血管壁、组织及实体瘤;(5)体内血循环半衰期短,易从血循环中排除;(6)在其基因的3’端连接适当的目的分子,如:酶、毒素、药物等可构建双功能抗体;(7)能直接与肿瘤细胞、病毒表面上的抗原结合;(8)由于分子量小,在大肠杆菌中的表达优于完整抗体;(9)因只能与抗原结合,不能激活补体介导细胞免疫;(10)由于是单价抗体,仅有一个抗原结合位点,其亲和力和稳定性较单抗低。近年,单链抗体已逐渐成为基因工程抗体研究领域中的热点课题。

    2  单链抗体的构建

    在单链抗体的构建过程中,VH、VL主要有以下3种来源:首先,利用RT-PCR技术从稳定分泌单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞中扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后以一人工编码的易折叠的Linker多肽序列,将VH、VL构建成完整的单链抗体基因片段。目前单链抗体的构建主要采取这一路线。其次,可以从人的外周血淋巴细胞中提取mRNA,通过表面呈现抗体片段噬菌体技术[2]进行PCR扩增而获得单链抗体可变区基因。该法绕过杂交瘤技术,并随机组合人表达载体,能建立巨大容量的抗体库,实现对特异抗体的筛选;但此方法过程复杂、技术要求高、时间长。最后,通过转基因技术将人抗体的某种目的基因位点转移到小鼠的基因组内,分别建立含人重、轻链基因组小鼠;再将这两种小鼠进行杂交,从中获得含人重、轻链基因组的小鼠。但此法涉及大片段DNA的操作,目前看来技术难度较大。

    在完整抗体结构中,抗原结合位点的稳定性是由VH、VL链间的非共价键以及CL、CH链C末端的二硫键共同维持,而C区对抗原结合位点的构成无影响。在单链抗体中,Linker承担了与CL和CH1间相互稳定作用的功能,维持VH和VL间的构象。具体连接方式可以是VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。

    Linker接头的设计对于单链抗体的亲和力有重要影响,其长度及性质应不干扰VH和VL的立体折叠,且不对抗原结合部位造成妨碍。一般接头不应过短,至少含有10个氨基酸;同时不宜过长,在25个氨基酸以下。为减少可变区之间,或接头与可变区间的相互作用,应尽量选择亲水性且不含侧链的氨基酸组成Linker。根据以上原则,借助于计算机进行辅助设计可构建不同的接头。目前采用最为广泛的Linker是[(Gly)4Ser]3[3]。

    3  单链抗体的表达

    目前,应用于单链抗体的表达有多种系统,如细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。但大肠杆菌E.Coli因具有易于操作、成本低、研究周期短等优点,是目前用于表达有抗原结合活性的ScFv、Fab等片段小分子抗体的最常用表达系统。虽然该系统无法完成对表达蛋白的各种修饰,但抗体的糖基化是发生在重链的恒定区,且与抗体的抗原结合活性无关。单链抗体的表达主要有3种形式:(1)在胞质中表达,抗体片段以包涵体形式存在。其优点是可防止宿主对抗体片段的降解,但分离后还要进行复性、折叠等处理。(2)以胞质融合蛋白形式表达。此表达的关键是要考虑运用特异的融合蛋白裂解方式。(3)具有功能的分泌表达。直接在大肠杆菌中分泌表达活性抗体,不需对表达产物进行复性、折叠、水解某些融合成分等,但此时一般单链抗体的产量较低,每升仅含数毫克[4]。

    另外动物细胞、哺乳动物细胞和噬菌体也都可作为单链抗体的表达宿主,但由于周期长、操作复杂等原因,不常用于单链抗体的表达。单链抗体的表达机制目前不十分清楚,其表达量的多少与多种因素密切相关,如Linker长度、蛋白质水平、翻译转录水平、宿主菌生长状态、受体菌类型、诱导表达时间长短、表达方式、转染条件、表达产物pH值及浓度等[5]。

    4  单链抗体的应用

    4.1  单链抗体可用于一些基础理论的研究  单链抗体是具有抗原结合能力的小分子,构建时又易于进行定点突变,这就为利用X-射线晶体衍射和多维核磁分析等研究抗原-抗体结合过程中结构和功能的关系提供了极有价值的研究对象。另外,在开展抗核酸单链抗体的研究,探索自身免疫疾病机制,研究特殊构型如Z-DNA、三链DNA以及蛋白质对DNA特殊序列与构型的识别机制等方面都有重要用途。

    4.2  临床上单链抗体可用于构建和生产免疫毒素  免疫毒素是由抗体与毒素分子相连接而成,抗体将毒素定位于靶细胞,对靶细胞进行特异杀伤。完整抗体免疫毒素存在不稳定性和免疫原性,限制其临床应用。单链抗体免疫毒素是通过单链抗体基因C末端与毒素基因连接,直接在大肠杆菌中表达重组免疫毒素。较完整抗体免疫毒素具有操作更简单、廉价、免疫原性低和易于透入肿瘤组织内部等优势,可达到更佳疗效。Benhar等[6]通过对ScFv-PE30单链抗体免疫毒素的研究,证实此单链抗体免疫毒素的疗效明显优于完整抗体免疫毒素,而且毒副作用明显减低。单链抗体免疫毒素易于大量生产,在临床上具有广阔的应用前景。

    4.3  单链抗体可用于肿瘤的影像分析和治疗[7]  如果将针对肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的标记抗体注入体内,则可通过放射性浓集情况对肿瘤进行定位,所产生的内照射效应还可以起到放射性免疫治疗的作用。传统抗体由于分子量大,对肿瘤的穿透性差,仅有极少部分能到达肿瘤部位(约0.001%~0.01%),从而导致本底升高,并影响影像分析与治疗的效果。单链抗体分子量较小,可以更快、更多地进入肿瘤内部,使肿瘤定位图像清晰,还可避免非特异性损伤[8]。

    4.4  单链抗体还可应用于免疫诊断、基因治疗、食品卫生及药品研制等多方面  细胞内免疫是在细胞内表达特异识别某一病毒编码蛋白的抗体,抑制病毒在细胞内传播。在细胞内直接克隆和表达抗多种病毒蛋白的单链抗体,可尽快和有效地标记病毒生存周期各个阶段的不同蛋白,用于病毒感染的预防及诊断。目前,单链抗体已应用于AIDS及其他多种病毒性疾病的诊断及治疗。

    5  单链抗体的前景展望

    近年来,有关单链抗体的研究进展迅速,在基础理论研究和临床应用方面都取得了一定的成果。但由于单链抗体是单价抗体,可通过构建双价ScFv(DSFv),改善ScFv的亲和活性[9];将噬菌体表面呈现技术应用于ScFv的筛选,筛选出高亲和力和特异性更强的ScFv;通过C末端连接另外单链抗体基因,构建和表达双特异单链抗体,应用于肿瘤的诊断和治疗;可与IL-2、INF等细胞因子基因连接,使细胞因子特异性杀伤肿瘤细胞,增强抗肿瘤活性,降低其毒副作用等。同时,如果能进一步提高单链抗体的稳定性及表达量,开拓免疫毒素及其他新型免疫融合蛋白的研究范围等,单链抗体的应用会日趋广泛,在服务于人类健康的同时带来更多的经济效应[10]。

    【参考文献】

    1  Elliott MJ,Maini RN,Feldmann M.Repeated therapy with monoclonal antibody to tumor necrosis factor α(cA2) in patients with rheumatoid arthritis.Lancet,1994,344(8930):1125-1127.

    2  张志超,胡学军,包永明,等.大容量人源单链抗体库构建中轻链重链可变区的连接.免疫学杂志,2001,17(6):472-474.

    3  Huston JS,Levinson D,Mudgett-Hunter M,et al.Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA,1998,85(16):5879-5883.

    4  Verma R,Boleti E,George AJT.Antibody engineering:comparison of bacterial,yeast,insect and mammalian expression systems.J Immunol Methods,1998,216(1-2):165-181.

    5  Yang J,Moyana T,Mackenzie S,et al.One hundred seventy-fold increase in excretion of an FV fragment-tumor necrosis factor alpha fusion protein (sFv/TNF-alpha) from escherichia coli caused by the synergistic effects of glycine and triton X-100.Appl Environ Microbiol,1998,64(8):2869-2874.

    6  Benhar I,Reiter Y,Pai LH,et al.Administration of disulfide-stabilized Fv-immunoloxins Bl(dsFv)-PE38 by continuous infusion increases their efficacy in curing large tumor xenografts in nude mice.Int J Cancer,1995,62(3):351-355.

    7  毕向军,杨冬华,陈湖.单链抗体在肿瘤治疗中的应用.实用肿瘤杂志,2002,17(3):213-215.

    8  Yokota T,Milenic DE,Whitlow M,et al.Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglubin forms.Cancer Research,1992,52(12):3402-3408.

    9  Cho BK,Roy EJ,Patrick TA,et al.Single-chain Fv/folate conjugates mediate efficient lysis of folate-receptor-positive tumor cells.Bioconjug Chem,1997,8(3):338-346.

    10  刘燕.单链抗体的研究进展及其应用前景.中国兽药杂志,2003,37(11):42-44.

     作者单位: 1 210046 江苏南京,南京中医药大学中西医结合系

    2 210002 江苏南京,南京军区南京总医院全军医学检验中心

   (编辑:丁  薇)


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