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调心方有效部位对类AD大鼠大脑神经生长因子及其受体p75的影响

来源:中华现代中西医杂志 作者:杨戈林水淼赵伟康周如倩徐品初郁志华 2006-8-20
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摘要: 【摘要】 目的 研究调心方有效部位(TX0201)对Aβ25-35所致类AD模型大鼠脑组织神经生长因子(NGF)及其受体p75调节机制的异同。方法 采用双侧杏仁核注射Aβ25-35造成类AD大鼠模型,观察大鼠Morris水迷宫空间记忆能力,并分别通过免疫组化和RT-PCR方法研究类AD大鼠神经元NGF及其受体p75和APP mRNA变化以及TX0201的影响。......


    【摘要】  目的  研究调心方有效部位(TX0201)对Aβ25-35所致类AD模型大鼠脑组织神经生长因子(NGF)及其受体p75调节机制的异同。方法  采用双侧杏仁核注射Aβ25-35造成类AD大鼠模型,观察大鼠Morris水迷宫空间记忆能力,并分别通过免疫组化和RT-PCR方法研究类AD大鼠神经元NGF及其受体p75和APP mRNA变化以及TX0201的影响。结果  类AD模型大鼠Morris水迷宫测试出现空间记忆能力下降,APP mRNA表达提高,神经生长因子减少,神经系统失去了营养保护。TX0201能有效控制以上病理变化。结论  TX0201提高模型大鼠定向学习记忆能力,可能通过降低皮层、海马部位APP mRNA的表达,增加NGF阳性样细胞、减少p75受体阳性样细胞调节神经营养而发挥作用。提示通过有效调节神经生长因子是TX0201的重要作用机制之一。

  【关键词】  老年性痴呆;调心方有效部位;多奈哌齐;β-淀粉样蛋白;神经生长因子
   
  Effects of TX0201 on nerve growth factor and p75 in rats

  YANG Ge,LIN Shui-miao,ZHAO Wei-kang,et al.

  Xiyuan Hospital,Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100091,China

  【Abstract】  Objective  To research the mechanism of TX0201 abstracted from‘Heart-Regulating Formula’in treatment of rat with Alzheimer’s disease(AD).Methods  The rat model of AD were induced by Aβ25-35 injected into the bilateral amygdala.To observe the spatial learning and memory ability,and by means of RT-PCR and immunohistochemistry analysis methods,in the brain of the model animal,the expression of β-amyloid precursor protein(APP),nerve growth factor(NGF)and its receptor were examined.Results  In AD model group,the spatial learning and memory ability was damaged significantly,the expression of APP mRNA increased in its cortex and hippocampus.NGF immunopositive signal decreased.TX0201 improved the spatial learning and memory disturbance,decreased the expression of APP mRNA and increased NGF in its cortex and hippocampus.Conclusion  The model showed the characteristic of AD,such as memory hypofunction.TX0201 could partially ameliorate above mentioned changes obviously in brain of the rat model.It ameliorated memory function,decreased the expression of APP mRNA in hippocampus,regulated nerve growth factor.

  【Key words】  Alzheimer’s disease;TX0201;E2020;β-amyloid precursor protein;nerve growth factor

    老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)是老年期痴呆中最常见的一种,是由于脑内神经结构发生病变而引起的以记忆力丧失和认知功能障碍为主要特点的退行性脑病。随着社会人口的老龄化,其发病率呈上升趋势。

  神经生长因子(NGF)对神经系统的营养作用已被许多体内、外的实验所证实。在早期的研究中观察到,神经组织细胞在体外培养的存活有赖于NGF的存在。NGF在大脑皮层、海马等部位合成,经基底前脑胆碱能纤维轴突摄取,逆行运输至胞体提供营养,对其神经元的存活和轴突的再生发挥重要作用。Mufson等学者提出AD脑中NGF的逆向转输障碍可能是AD中基底前脑胆碱能神经元(BFCNs)退化的始发因素,而后者正是公认的导致AD学习记忆障碍的原因。为此,我们在关于调心方的一系列研究基础上[1~3],针对目前国内外未见中药复方有效部位调节Aβ诱导的神经毒性作用的研究,拟环绕AD主要病理环节,从细胞和分子水平进一步探讨调心方有效部位(TX0201)对Aβ所致类AD模型大鼠学习记忆能力、APP mRNA,NGF及其受体p75的影响。

  1  材料与方法

  1.1  动物  雄性SD大鼠:清洁级,体重(250±30)g,由上海中医药大学实验动物中心提供。

  1.2  药物  TX0201由中药党参、茯苓、桂枝、远志等组成,经D101大孔树脂吸附、分离、提取,总皂苷含量>50%,含量为29.8g/ml,由上海市中医老年医学研究所提供;多奈哌齐(E2020,lot:01H 02R),每片含盐酸多奈哌齐5mg,由英国Boots公司生产。

  1.3  试剂和仪器  β-淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35):Sigma产品。生物素化羊抗兔IgG:Vector Lab。ABC Kits:Vector Lab。DAB染色试剂盒:武汉博士德生物公司。随机引物:上海生工生物有限公司。dNTP、M-MLV Reverse Transcriptase:GIBCOBRL公司。Taq聚合酶、Rnase inhibitor(Promega):上海申能博彩生物有限公司提供。江湾Ⅰ型C立体定向仪:上海川沙花木农机厂产品。Morris水迷宫:上海市中医老年医学研究所提供。图像分析仪:ImageMaster VDS,Quantimet 520。全能图像分析系统:Cambridge Instrument。光学显微镜:OLYMPUS DP70 U-TV 0.5XC-2 4A21026,JAPAN。

  1.4  Aβ杏仁核注射类AD模型的建立  除正常对照组外,其余各组均将Aβ25-35片段注入大鼠双侧杏仁核,通过Aβ的神经毒性作用,造成类AD模型。具体方法:参照文献[4~6]以3%戊巴比妥钠30mg/kg经腹腔麻醉大鼠,将大鼠以前齿与双内耳水平面固定于大鼠脑立体定位仪上,剪去颅顶切口区毛,作颅顶正中切口,以前脑基底核(nucleus basalis of Meynert,NBM)水平标准位,前囟中心为零点,前囟后3.2mm,双侧旁开4.3mm,深8.4mm,各注射5μmol Aβ25-35(用0.1%的三氟乙酸溶解),缓慢注射,每侧注射时间5min,留针5min后缓慢退出,局部消毒,缝合皮肤,臀部肌注青霉素。

  1.5  分组与处理  经环境适应性饲养1周后,于造模前进行水迷宫训练3天,剔除差异明显者。称体重后按随机数目表随机分为5组:正常对照组、类AD模型组、调心方有效部位大剂量组、调心方有效部位小剂量组、多奈哌齐组。依标准动物体质量法,调心方有效部位大、小剂量组、多奈哌齐组给药量分别相当于60kg成人用药量的40、20、10倍(其中调心方有效部位大、小剂量组给药量为该药小鼠水迷宫筛选测试有效剂量)。分别于造模后第2天灌胃,1次/d,其余各组用等量的双蒸水灌胃,连续2周,迷宫测试期间,于测试前30min给药。第15天处死动物,迅速取出大鼠脑组织,分取皮层、海马,并存放于-80℃冰箱冻存。

  1.6  观察指标及检测方法

  1.6.1  大鼠学习记忆神经行为学测试  采用Morris水迷宫法,水迷宫由上海市中医老年医学研究所提供,水迷宫圆形,直径1.5m,平台直径12cm。各组大鼠在灌胃开始后第10天进行水迷宫测定,实验在暗室中进行,将大鼠移至暗室中适应30min后开始测试。平台置于迷宫东北象限正中,水面高出平台15mm,水温保持在19℃~20℃。每天测定时大鼠分别从正西、正南两个点放入迷宫中2次。设定最长游动时间为70s,记录大鼠找到平台所需时间,或称潜伏期(escape latency)。

  1.6.2  免疫组化检测NGF、p75  大鼠经左心室灌注固定(4%多聚甲醛,0.1M磷酸缓冲液,pH 7.2),剥取大脑,按常规固定、脱水、冷冻切片,切片厚30μm。采用亲和素-生物素-过氧化物酶技术(SABC法)[7]检测大脑组织中的NGF、p75的表达。兔抗鼠NGF、p75单克隆抗体,稀释度分别为1∶350、1∶250。

  1.6.3  RT-PCR检测[8,9]  给药2周后,将大鼠断头处死,迅速剥取全脑,分离海马、皮层组织,置液氮保存备用。

  1.6.3.1  总RNA抽提  采用异硫氰酸胍/酚/氯仿抽提法提取组织总RNA,紫外分光光度计260/280nm测RNA浓度,在甲醛-MOPS凝胶电泳缓冲液中1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。

  1.6.3.2  逆转录反应  GIBCOBRL公司的M-MLV逆转录酶,取2μl RNA样品,20μl反应体系,操作按说明书进行。

  1.6.3.3  引物设计  在GeneBank中查找目的基因的mRNA序列,应用xPrimer软件设计引物。其序列为:

    APP mRNA(NM_019288)共2341 bp

  sense:    5’-AGG AGG AAG TGG CCG ATG TT-3’

  antisense:  5’-GGA AAT GCT GCA TAA CGG CC-3’

    产物APP695 371bp,APP751 539bp

    β-actin(378bp)

    sense:    5’-CCA GCC ATG TAC GTT GCT ATC CAG -3’

    antisense:  5’-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TGG TGA -3’

    β-actin作为“看家基因”监控RNA使用量,以消除不同样本间加样误差。

  1.6.3.4  PCR扩增  PCR反应总体积50μl包括:10×PCR buffer 5μl,上、下游引物各(50pmol/μl)1μl,dNTP(10mM)1μl,Mg2+(25mM)3.2μl,cDNA模板2μl(2μg),Taq聚合酶(5u/μl)1μl,加ddH2O补足至50μl,震荡混匀,高速离心10s后加入30μl液状石蜡,置PCR热循环仪(Pharmacia LKB)扩增,扩增条件为:APP:94℃预变性4min,72℃ 1min,(94℃ 45s,50℃ 60s,72℃ 90s)×30个循环,72℃,7min。以上均采用热启动方式,预变性后,于72℃条件下加入TaqDNA聚合酶。

  1.6.3.5  PCR产物电泳鉴定  取10μl PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶100V电泳1h,紫外灯下拍照。

  1.7  图像处理  采用Quantimet 520全能图像分析系统对载玻片上的GFAP免疫组织学图像进行处理。本实验所用图像分析系统的灰度等级为0(黑)~256(白),测定框面积为45353.0(155×198)μm2,每部位测定3次,取平均灰度,计算平均光密度值。公式为:OD=(阳性总灰度-阳性像素点×本底总灰度/本底像素点)/阳性像素点。对PCR电泳产物应用LEICA Q500IW图像分析系统进行图像扫描分析。

  1.8  统计学方法  计量资料用(x±s)表示,用计算机统计软件SPSS 10.0处理,进行方差分析,P<0.05表示差异有显著性。

  2  结果

  2.1  实验大鼠大脑学习记忆神经行为学的变化及药物的影响测试结果  见表1。以大鼠Morris水迷宫的时间计,第1、2、3天,实验各组差异无显著性(P>0.05);第4、5天,模型组明显长于其他各组,各用药组时间明显短于模型组(P<0.05)。

  2.2  实验大鼠大脑神经生长因子NGF及其受体p75在皮层海马部位表达的变化及药物影响  见表2、表3。

  表1  TX0201和EGb 761的Morris水迷宫作用  (略)

  表2  大鼠海马、皮层NGF蛋白免疫组化阳性信号积分光密度变化  (略)

    表2示,海马CA2区和皮层NGF,类AD模型组显著低于正常对照组(P<0.01);两个调心方有效部位组显著高于类AD模型组和多奈哌齐组(P<0.01),并接近正常对照组,而多奈哌齐组与类AD模型组之间没有明显差异。

  表3  大鼠海马、皮层p75蛋白免疫组化阳性信号积分光密度变化  (略)

    表3示,海马CA2区和皮层p75,类AD模型组显著高于正常对照组(P<0.01);两个调心方有效部位组显著低于类AD模型组和多奈哌齐组(P<0.01)并接近正常对照组,而多奈哌齐组与类AD模型组之间没有明显差异。

  2.3  实验大鼠大脑皮层、海马部位APP mRNA表达的检测

  2.3.1  总RNA的甲醛-MOPS凝胶电泳鉴定结果  总RNA经紫外分光光度法检测显示,260/280nm OD值比值介于1.8~2.0之间,5μl总RNA电泳鉴定可见28S、18S、5S区带,28S明显多于18S,条带清晰,无其他大分子条带,表明总RNA无蛋白污染,无降解。

  2.3.2  实验大鼠大脑皮层、海马部位APP695 mRNA表达结果的变化及药物影响  见表4。

  表4  各组大鼠海马、皮层部位APP695 mRNA表达的变化  (略)

  由表4实验结果可见,海马APP695 mRNA,类AD模型组明显高于正常对照组(P<0.05);两个调心方有效部位组和多奈哌齐组均明显低于类AD模型组(P<0.05)。
皮层APP695 mRNA,类AD模型组明显高于正常对照组(P<0.05);两个调心方有效部位组均明显低于类AD模型组(P<0.05),接近正常对照组。而多奈哌齐组与类AD模型组之间没有明显差异。

  3  讨论

  NGF是最早发现的细胞生长调节因子,其作用是促进神经生长发育,维持其正常的功能。其作用机制十分复杂,涉及神经元的诸多方面,已发现其主要是通过胆碱能神经递质系统发挥作用,用于认识功能改善,已引起了医学界的高度重视。研究表明,AD与缺乏NGF的营养支持有关,NGF能有效防止动物基底前脑损伤所致胆碱能神经元变性、死亡,并可改善老年动物的学习记忆功能。NGF主要是由受体介导通过激活受体而发挥神经元的营养支持作用的。

  调心方以党参补心气,安神明;以远志、菖蒲、茯苓等振心阳,化痰浊、通心窍。用之于临床,确能有效改善AD患者记忆力、智力及认知功能和生活能力。本实验选用的TX0201是从调心方中提取筛选出的主要有效部位之一。

  我们的实验结果表明,类AD模型大鼠皮质、海马NGF阳性细胞表达明显减少;调心方有效部位大小剂量能明显增加NGF阳性样细胞;而多奈哌齐作用不明显。这一点也表明NGF含量降低是AD模型大鼠学习记忆能力降低的原因之一。调心方有效部位大小剂量可能通过改善这一变化而改善大鼠学习记忆能力。

  NGF通过与神经元的受体结合而发挥生物学效应,有高亲和力酪氨酸蛋白激酶TrkA和低亲和力神经营养因子受体(p75NTR)两种受体。TrkA介导的是细胞存活信号途径,对于p75NTR原来只认为它是一种辅助性受体,近年来研究认为它具有逆行转输神经营养素、选择相应的神经营养、调节神经营养因子的酪氨酸激酶受体的信号传递和介导细胞凋亡等多方面的功能。Rabizadeh等学者提出,p75受体可能起诱导凋亡机制的作用,他们观察,未与NGF结合的p75NTR诱发凋亡机制,而与NGF结合的p75受体则抑制凋亡机制,因此p75受体的表达可以解释某些神经元存活对NGF的依赖。

  脊椎动物发育早期神经细胞数量是最后存活数的2~3倍,确立神经细胞群落的最后规模是通过那些不能很好地与相应靶细胞发生相互作用的神经元的死亡来实现的,这一过程已被证明由神经营养性因子介导,失去营养支持的神经元通过凋亡过程而死亡。在慢性神经退行性病变中同样可以观察到相似的现象。Yaar等发现神经元在丢失前普遍表达一种75kD的p75NTR,推测该因子与βA4相互作用可介导细胞凋亡。

  我们的实验提示,类AD模型大鼠皮质、海马p75受体阳性细胞表达明显增多,与NGF的实验结果结合来看,恰恰说明类AD模型大鼠在皮层、海马部位神经细胞凋亡的可能性增加,神经营养的作用减少了;调心方有效部位大小剂量可能通过明显减少p75受体阳性样细胞,而起到降低大鼠皮层、海马部位神经细胞凋亡的可能性;多奈哌齐在这一方面作用不明显。提示TX0201改善Aβ大鼠的学习记忆力的作用机制不是与显著提高ChAT活性和M受体结合容量相关[10],而是能通过调节神经生长因子及其受体,改善AD的病理过程,提示TX0201治疗AD可通过多系统、多层次作用机制而发挥功效,体现了中药的整体调整特点。

  【参考文献】

  1  林水淼,杨柏灿.养心健脑液治疗Alzheimer痴呆的临床研究.上海中医药大学学报,1997,11(1):44.

  2  周晖,赵伟康.调心方对Aβ大鼠痴呆模型空间学习记忆障碍和胆碱能系统的影响.中药药理与临床,1998,14(3):29-31.

  3  赵伟康,戴向东.调心方对痴呆大鼠模型N受体和神经肽的作用研究.中国中西医结合杂志,1995,基础理论特辑:194.

  4  Sofroniew MV, Pearson RCA. Degeneration of cholinergic neurons in the basal nucleus following kainic or N-methy1-D-aspartic acid application to the cerebral cortex in the rat. Brain Res,1985,339:186-190.

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  9  Murphy FG, Grodine J, Altares M, et al. Induction of interleukin-6 in axotomized sensory neurons, J Neurosci,1995,16:5130.

  10  Blasko I, Veerhuis R, stampfer KM, et al. Costimulatory effects of gamma and IL-1β or TNF-α on the sythesis of Aβ-40 and Aβ-42 by human astro cytes. Neurobiol Dis,2000,7:682-689.

  作者单位:1 100091 北京,中国中医研究院西苑医院

       2 200032 上海,上海市中医老年医学研究所

  (编辑:李建伟)


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