当前位置:首页 > 医源资料库 > 在线期刊 > 中国热带医学杂志 > 2008年第8卷第8期 > 免疫金银染色法检测自身免疫性疾病患者抗核抗体研究

免疫金银染色法检测自身免疫性疾病患者抗核抗体研究

来源:中国热带医学 作者:张铁汉 赵永新 刘晓军 张帮杰 王伟娟 2010-1-13
336*280 ads

摘要: 结论 IGSS可用于检测自身免疫性疾病患者血清抗核抗体(ANA)。 【关键词】 自身免疫性疾病 抗核抗体 免疫金银染色 抗核抗体(ANA)是自身免疫性疾病非常重要的实验诊断指标。间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence IIF)是检测抗核抗体(ANA)最有效的方法和金标准[1]。但间接免疫荧光法需要特殊设......


【摘要】  目的 探讨免疫金银染色法检测抗核抗体(ANA)对自身免疫性疾病患者的诊断价值。 方法 采用免疫金银染色法(IGSS)和间接免疫荧光法(IIF)检测自身免疫性疾病患者血清中ANA。 结果 80例自身免疫性疾病患者血清免疫金银染色法检测抗核抗体(ANA)阳性率97.3%,间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA)阳性率98.2%, χ2=1.006,P=0.316>0.05)。两种方法结果有良好一致性。 结论 IGSS可用于检测自身免疫性疾病患者血清抗核抗体(ANA)。

【关键词】  自身免疫性疾病 抗核抗体 免疫金银染色

抗核抗体(ANA)是自身免疫性疾病非常重要的实验诊断指标。间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence IIF)是检测抗核抗体(ANA)最有效的方法和金标准[1]。但间接免疫荧光法需要特殊设备(如高质量荧光显微镜),限制了抗核抗体(ANA)检测技术在基层医院实验室的开展,造成许多自身免疫性疾病在基层医院漏诊、误诊。为使基层医院提高对自身免疫性疾病诊断的准确性,我们借鉴免疫金银染色在病理学诊断中的高敏感性和高特异性[1~3],建立了利用普通光学显微镜检测血清抗核抗体的免疫金银染色法(Immunogold silverstaining,IGSS),取得满意效果,报告如下。

  1  材料和方法

  1.1  抗原  欧蒙德国医学实验诊断公司,订货号FA 1510-1003-1靶抗原基质人HEp-2细胞,猴肝切片(每个反应区2张生物薄片)

  1.2  待检血清  自身免疫性疾病患者血清 为2002年以来本院血清库收集的新乡市各医院送检的自身免疫性疾病患者血清(其中系统性红斑狼疮25例,干燥综合征20例,系统性硬化症15例,混合结缔组织病20例),所有患者均符合1982年美国风湿病协会诊断标准。正常对照血清为新乡市中心血站无偿献血员血清,共46份。

  1.3  金标记羊抗人IgG

  1.3.1  亲合层析提纯羊抗人IgG为华美生物工程公司产品。

  1.3.2  胶体金溶液  由本实验室参考全国临床检验操作规程[1]通过鞣酸—枸橼酸钠还原法制备直径为5nm的胶体金溶液。

  1.3.3  待标记蛋白溶液的制备  将待标记蛋白羊抗人IgG预先于0.005mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000g 4℃离心1h,去除聚合物。

  1.3.4  待标胶体金溶液的准备  以0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调胶体金液的pH值至9.0。

  1.3.5  胶体金与标记蛋白用量之比的确定  将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml。将标记蛋白羊抗人IgG以0.005mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5~50μg/ml,分别取1ml,加入上列胶体金溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。结果观察,以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量。

  1.3.6  胶体金与羊抗人IgG的结合  将胶体金和羊抗人IgG溶液分别以0.1mol/L K2CO3调pH至9.0,电磁搅拌羊抗人IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入5%BSA作为稳定剂,防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀,溶液终浓度为1%。

  1.3.7  胶体金标记蛋白的纯化  先低速离心1 800r/min 20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g,4℃离心1h;仔细吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PBS液(含0.02%NaN3),将沉淀重悬为原体积的1/10,4℃保存。在结合物内加50%甘油贮存于-70℃可保存一年以上。

  1.3.8  金标抗人IgG的质量鉴定  胶体金颗粒在波长510~550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA,0.02%NaN3)将胶体金蛋白试剂作1:20稀释,在721分光光度计上测OD520=0.26,符合要求。(一般应用液的OD520应为0.2~0.4)。

  1.4  银染液配制  采用本实验室[4]配方液,A液:0.22%乙酸银溶液。B液: 50%阿拉伯树胶,去离子水溶解,每天摇动,5d后取滤液使用;C液:1%对苯二酚溶液,500mg对苯二酚溶于30ml 0.05mol/L pH3.8柠檬酸盐缓冲液中。D液:在C液中加入10~40ml B液。银染液:将A液和D液等量混合即成(临用前配)。

  1.5  稀释液及洗液  pH7.2,0.01M PBS-Tween20缓冲液。

  1.6  检测流程  ①稀释:用稀释液稀释血清。 ②加样:将加样板放在泡沫板上,按顺序分别滴加25μl稀释后的血清至加样板的反应区中,避免产生气泡。③第一次温育:将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下,盖在加样板的凹槽里,反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触,且标本间互不接触。室温温育30min。 ④清洗:用烧杯盛PBS-Tween洗涤液,流水冲洗载片1s然后立即(不要吹干)将其浸入装有PBS洗涤液的小杯中浸洗至少1min。⑤加样:滴加25μl 1∶20稀释的金标记羊抗人IgG至洁净加样板的反应区中。⑥第二次温育:从PBS洗涤液中取出载片(抗原片),5s内用吸水纸擦一下背面和边缘后,立即将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下,盖在加样板的凹槽里。检查生物薄片是否与液滴接触良好,然后继续下一张。室温温育30min。⑦清洗:用烧杯盛PBS洗涤液流水冲洗载片1s,然后立即将其浸入装有PBS洗涤液的小杯中浸洗至少1min。再将其浸入去离子水的小杯中浸洗至少1min 2次,浸入双蒸水的小杯中浸洗至少1min 1次。⑧银染:滴加25μl 混合后的银染液至洁净加样板的反应区中加混合后的银染液, 从双蒸水的小杯中取出载片(抗原片),5s内用吸水纸擦一下背面和边缘后,立即将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下,盖在加样板的凹槽里。注意:为防止破坏基质,不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片(抗原片)是否与液滴接触良好,然后继续下一张。室温温育10min。⑨清洗:用烧杯盛去离子水流水冲洗载片1s(注意水流不要太急,不要直接对着基质冲),然后立即将其浸入去离子水的小杯中浸洗至少1min 3次。⑩镜检:晾干后光学显微镜10×40下观察细胞核着色情况。ANA阳性反应为细胞核内结构被染成黑色,阴性为核区不着色,在浅灰色的背景下呈白色空泡状; ANA血清滴度≥1∶20为阳性。

  1.7  间接免疫荧光法检测试剂(ANA筛查试剂盒),欧蒙德国医学实验诊断公司,严格按说明书操作。用荧光显微镜10×40观察结果。

  2  结果

  2.1  免疫金银染色法与间接免疫荧光法检测ANA比较  免疫金银染色法(IGSS)与间接免疫荧光法(IIF)检测SLE患者ANA血清80份,结果见表1,符合率 98.8%,χ2=1.006,P=0.316>0.05。差异无统计学意义。

  2.2  重复性试验  ANA阳性、阴性血清各3份,同一批试验各做4份,结果阳性标本均阳性,阴性标本均阴性。

  2.3  其他标本检测  用IGSS法检测46份健康献血员血清,均为阴性。

  表1  免疫金银染色法与间接免疫荧光法(IIF)检测 ANA对比结果(略)

  Tab 1  Detection of ANA in 80 autoimmune disease serum with IGSS

  2.4  ANA滴度分布  每份血清均以1∶10开始倍比稀释。用两种方法同时检测,结果表明, IGSS法的平均滴度均高于IIF法(t=0.874,P=0.384>0.05)。差异无统计学意义。

  表2  80例自身免疫性疾病患者血清两种方法ANA阳性滴度分布(略)

  3  讨论
   
  ANA即抗细胞核成份的抗体,是所有抗核抗体的总称。到目前为止,至少发现有30种抗核成份的抗体,这些核抗原主要分布在细胞核内,但也有分布在核周的胞浆内。ANA最早用于诊断系统性红斑狼疮,目前作为系统性红斑狼疮和其他系统性风湿病的筛选试验诊断,具有很高的敏感性,但缺乏特异性。检测ANA的经典方法有间接免疫荧光和ELISA两种方法,在实验室操作和临床意义方面两者有差异。间接免疫荧光常用的底物为有核组织细胞,如猴肝、鼠肝或鼠肾组织细胞;也用肿瘤细胞株,如子宫颈癌细胞(Hela cell)或喉癌细胞(Hep-2 cell)。由于癌细胞的核更大,增殖活跃,细胞的分裂期明显,故更易观察和分析结果。依照细胞核染色的类型分为:斑点型(Speckled,S型)、均质型(Homogeneous,H型)、周边型(Peripheral,P型)、核仁型(Nucleolar,N型)和核浆点型或着丝点型(Antibody to centromere antigen,ACA)5型。
   
  依照抗原的生物化学特性将ANA分为4大类:抗DNA类、抗组蛋白(histone,H)类、抗非组蛋白类即抗可提取性核抗原(Extractable nuclear antigen,ENA)类和抗核仁类抗体。共有30余种抗体,其中临床常用10余种,构成ANA谱。根据各抗原特性,采用不同的试验方法检测相应的抗体。①抗ds-DNA抗体的检测:经典的试验方法间接免疫荧光法,用马疫锥虫或短膜虫作为反应底物,虽其特异性较高,但敏感性较低;放射免疫法(结合率≥20%为阳性)和金标抗体测定法其实验结果特异性相对较低。②抗组蛋白抗体的测定曾用肾脏组织细胞作为反应底物,应用免疫荧光法,由于此抗原的稳定性较差,其实验的敏感性较低,故现采用ELISA较多。③抗非组蛋白(ENA)抗体的测定以往常以粗提的多组份ENA抗原为反应底物,用对流免疫电泳法测定,也称第二筛选实验。然后琼脂免疫双扩散方法,以粗提的单组份抗原为底物分别对相应的抗体测定。近年来,免疫印迹(Western Blotting)技术应用于临床,给临床检测抗体带来了许多方便,但两种方法测定抗体的阳性率基本相同,只是免疫印迹技术更简便、更科学化。由于目前所应用的反应载体是硝酸纤维膜,反应底物为提纯的多组份ENA多肽,某些试剂的稳定性尚存在一定问题,故通常琼脂免疫双扩散和免疫印迹两种方法同时做,以相互弥补其实验缺陷,提高其敏感性和特异性。④抗核仁抗体的测定通常应用间接免疫荧光法。
   
  1971年Faulk 和Taylor[1]建立了一种新的标记物系统—免疫胶体金技术用于免疫细胞化学,现在已应用于光镜和电子显微镜标本抗原和抗体的检测。胶体金的制备方法比较简便,标记抗体也较容易。1983年Holgate[1]等人将免疫金法与银显影方法相结合创立了免疫金银法(IGSS ),即经银显影液增强,使金颗粒周围吸附大量银颗粒,光镜下就可看到阳性反应部位呈金属银的黑褐色,从而提高了灵敏性。IGSS染色方法成功的关键在于要保持好的抗原性,组织结构,并要求有高特异性和高效价的抗体,严格避免金颗粒和银颗粒的非特异性沉积。本文应用欧蒙德国医学实验诊断公司制备的ANA抗原和双链DNA抗原,并自行制备抗人IgG胶体金,达到试验要求。在本实验中,用IGSS和间接免疫荧光法同步检测自身免疫性疾病病人血清中的ANA,结果显示出两种方法结果有良好一致性。在未配置荧光显微镜的实验室,可用IGSS法检测自身免疫性疾病患者血清抗核抗体(ANA)。但对核型的观察,IGSS似不如IIF法清晰。因此,应用IGSS法检测ANA阳性时,应进一步采用免疫印迹等方法检出不同种类的抗核抗体,结合临床,做出正确诊断。

【参考文献】
    [1] 叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社,2006,655.

  [2] Holgate CS. Immunogold silver staining:new method of immunostaining with enhanced sensitivity[J]. Histochem cytochem, 1983,31:938~944.

  [3] Beeley JE. Immunocytochemistry: A practical approach, 1st ed.[M]. Oxford: Oxford University Press Inc, 1993,115.

  [4] 张铁汉, 刘琳, 贺志安,等.银强化滴金免疫法检测肾综合征出血热IgM的研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2000,14(3):266.


作者单位:新乡医学院第三附属医院,河南 新乡 453003.


医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《免疫金银染色法检测自身免疫性疾病患者抗核抗体研究》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: