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胶体金试剂条在鼠疫监测中的应用

来源:中国热带医学 作者:张涛 冯志勇 海荣 刘小华 张曼碧 梁秋光 黄济英 2010-1-13
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摘要: 【摘要】 目的 探讨鼠疫胶体金试剂条在动物鼠疫血清学监测中的应用。 方法 股动脉采鼠血、分离血清,同一份血清分装在两个离心管中。其中一管血清56℃ 30min灭活,首先进行鼠疫间接血凝(IHA)的初筛试验。初筛阳性血清,经醛化吸收后,再进行复判试验,严格按照中华人民共和国鼠疫诊断标准“GB15991-1995”执行。...


【摘要】  目的 探讨鼠疫胶体金试剂条在动物鼠疫血清学监测中的应用。 方法 股动脉采鼠血、分离血清,同一份血清分装在两个离心管中。其中一管血清56℃ 30min灭活,首先进行鼠疫间接血凝(IHA)的初筛试验。初筛阳性血清,经醛化吸收后,再进行复判试验,严格按照中华人民共和国鼠疫诊断标准“GB15991-1995”执行。同时对初筛阳性的原血清样的另一管未灭活血清进行鼠疫胶体金免疫层析试剂条检测。 结果 在广东省鼠疫疫源地(雷州市)采集的鼠类血清799份中有7份血清发生非特异凝集,初筛假阳性率0.88%;在广东鼠疫历史疫区(佛山市南海区)采集鼠类血清601份中有31份血清发生非特异凝集,初筛假阳性率5.17%,经复判试验全部为阴性。相应的非灭活原血清样经胶体金试剂条快速检测也全部为阴性。 结论 鼠疫胶体金免疫试剂条检测的特异性高于间接血凝试验,可同时作为间接血凝复判中的平行试验参考。在广东不同地区来源的鼠类血清样本中,历史疫区的IHA假阳性率明显高于现在的疫源地。

【关键词】  鼠疫监测 间接血凝 非特异凝集 胶体金免疫试剂条

在家鼠鼠疫动物监测中,间接血凝试验(IHA)的假阳性发生率远高于我国北方的野鼠鼠疫疫源地。很可能是由于家鼠种群密度高与人类接触频繁、生存环境复杂等因素。野鼠由于远离人类居住环境,相对生存环境比较单一和干净。家鼠由于生存环境复杂,受到微生物侵袭及感染的几率较大,体内血清中可能携带多种病原微生物的抗体及抗原成分。在这些抗体中,很可能由1~2种抗体会与鼠疫菌全菌抗原成分中的某种抗原发生交叉免疫反应,从而出现鼠疫间接血凝试验中的非特异凝集反应。甚至直接与致敏血球发生凝集反应。为此近年来,我们加强了这方面资料的收集与分析。

  1  材料和方法
   
  股动脉采集、分离鼠类血清,同一份血清分装在两个离心管中。其中一管血清56℃ 30min灭活后,进行鼠疫间接血凝初筛试验。初筛检出的阳性血清,经醛化吸收后,再进行复判试验,严格按照中华人民共和国鼠疫诊断标准GB15991-1995执行。同时对初筛阳性的原血清样(另一管非灭活)进行快速胶体金试剂条检测。鼠疫F1间接血凝试验检测试剂盒,统一由中国CDC鼠疫、布氏菌病防治基地供给,鼠疫免疫胶体金试剂条由北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司生产(批号20060508)。同时收集假阳性反应血清的全血进行全血成分的细菌分离和培养。具体方法严格参照2002年中华人民共和国卫生部疾控司出版的鼠疫防治手册中的方法执行。

  2  结果
   
  在家鼠鼠疫疫源地-雷州市采集的799份鼠类血清中,鼠疫F1间接血凝初筛试验检出阳性血清7份,后经复判试验和免疫胶体金试验条检测证实为非特异凝集反应,属假阳性反应,假阳性率为0.88%。同时这7份假阳性反应血清的全血成分细菌学检验结果为阴性,排除杂菌污染血清的可能性。
   
  在鼠疫历史疫区-南海区采集的601份鼠类血清中,鼠疫F1间接血凝初筛试验检出阳性血清31份,后经复判试验和免疫胶体金试验条检测这31份全部为非特异凝集反应,属假阳性反应,假阳性率为5.17%。同时这31份假阳性反应血清的全血成分细菌学检验结果为阴性,排除由杂菌污染血清导致非特异凝集反应发生的可能性。
   
  合计检测鼠类血清标本1 400份,IHA初筛(假)阳性38份,复判试验和胶体金试剂条检测均为阴性,假阳性率0.27%。用中国CDC鼠疫、布氏菌病防治基地生产的鼠疫F1间接血凝试验检测试剂盒中的阳性参照血清作对照,发现北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司生产的鼠疫免疫胶体金试剂条:只有在IHA滴度≧1:160,才呈现阳性反应条带。
    
  在统计中发现,发生(鼠疫F1间接血凝试验)假阳性的鼠类血清全部为家栖的黄胸鼠和褐家鼠。经χ2检验。广东鼠疫历史疫区鼠类血清的假阳性率明显高于现疫源地区。

  3  讨论
   
  影响间接血凝的因素主要有:①配置溶液的离子浓度及酸碱度;②醛化血球的制作工序(单宁酸、醛化处理过程等)。③F1抗原的提取及纯化技术。④被检样品中含有异种凝集素或外源性凝集素所引起的非特异凝集反应。⑤由病原微生物之间交叉抗原或抗体所引起的非特异凝集反应。⑥被检血清的实验室交叉污染。⑦尽可能避免被检血样的反复冻融及其溶血。
   
  本资料中,将鼠疫F1间接血凝试验检出假阳性的38份原未灭活的血清,进行鼠疫血清的F1抗体胶体金试剂条检测结果全部为阴性。说明鼠疫F1抗体胶体金检测的特异性高于F1间接血凝试验,因此,鼠疫免疫胶体金试剂条可作为IHA复判平行试验参考。
   
  由于目前提纯的鼠疫菌F1抗原,是一种复合抗原成分,为此必须在提取工艺上进行革新,把目前我们提取所谓纯的F1抗原再通过透析、毛细管电泳及亲合层析技术,分离提取真正纯的F1抗原成分,用于鼠疫血清学诊断。提高鼠疫血清学诊断的特异、敏感和科学性。避免与其他抗原的交叉反应,阻止非特异凝集反应的发生。当然近年来随着单克隆技术的发展,鼠疫ELISA和免疫胶体金技术(特别是DIGFA)得以应用,其抗原检测特异及其灵敏性都很高。尤其是在快速诊断方面,显示出方便和快捷的特点。在抗体检测中,可结合鼠疫间接血凝初筛试验的结果,把胶体金标记的鼠疫免疫层析试剂条检测结果作为最后的确诊试验。但目前鼠疫金标-抗体检测中,灵敏度还较低,只对IHA滴度≧1:160的血清样本呈现阳性反应,存在一定的漏检率;同时还不能对全血样本直接检测,需在血清分离后才能检测。对此可考虑在检测条上加滤膜首先对全血成分进行滤过,然后检测。对多次反复冻融及其溶血的血清样品,经胶体金鼠疫免疫层析试剂条检测前后结果一致,不受影响。
   
  由于现在胶体金直接检测细菌响应信号微弱,对鼠疫菌浓度的检测下限为≧105cfu/ml,可考虑引入生物素-亲和素,将胶体金复合抗原作为夹心法的二次综合利用夹心式方法,胶体金复合抗体和延长微生物与抗体的结合时间等部分显著提高检测精确度,将SPR生物传感器对鼠疫菌检测的灵敏度提高到101cfu/ml。
   
  同时现在推广使用的鼠疫胶体金检测试剂条还无法定量。第一种定量检测可通过试剂条反应后颜色深浅的视觉比较,实现半定量结果,具体结果分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性;第二种是将检测线的反应剂设计成只能结合已知一定量的分析物,任何过量的分析物将会和下一条检测线结合,产生一个温度式的条带梯度。第三种是应用反射光密度计测量显色带或斑点的颜色强度,将颜色强度传化为数字指标,以实现定量检测。
   
  在胶体金快速诊断技术中应用生物传感器,通过检测阻抗信号的变化来测定抗原(或抗体)的含量。这些方法大多通过在生物分子上连接的酶,在一定条件下催化某一反应底物,产生一种非导电性物质,沉积于电极表面,使电极表面的阻抗增加,达到放大信号的目的。
   
  在广东不同地区来源的鼠类血清样本中,历史疫区鼠类血清标本的IHA初筛假阳性率明显高于现在的疫源地。其原因值得进一步探讨。同时建立以鼠疫噬菌体为病原学(特异性片段的PCR扩增)和血清学(抗原和抗体)的诊断方法。

【参考文献】
    [1] 张涛,海荣,徐冬蕾,等.鼠疫监测血清学中的非特异凝集反应[J].地方病通报,2006,21(1):

  [2] 张涛,冯志勇,邱峻荣.鼠疫高级细菌学[M].银川:宁夏人民出版社,2006,129~139.

  [3] A.J.Shepherd, D.E.Hummitzsch.Comparative test for detection of plague antigen and antibody in experimentally infected wild rodents[J].Clinical microbiology,1986,24(6):1075~1078.

  [4] L.E.Lindler, G.V.Plano, V.Burland,et al. Complete DNA sequence and detail analysis of the Y.pestis KIM5 plasmid encoding murine toxit and capsular antigen[J].Infect Immun,1998,66:5731~5752.

  [5] 张涛.鼠疫菌研究进展[J].中国地方病防治杂志,2006,21(5):273~275.


作者单位:湛江鼠疫防治研究所,广东 湛江 524000; 广东省农科院,广东 广州 510640; 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 100000


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