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阴道念珠菌的分型鉴定及药物敏感性试验

来源:中国热带医学 作者:郭静 贾冬梅 2010-1-13
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摘要: 【摘要】 目的 研究阴道炎致病念珠菌性的分型及药物敏感性,指导临床用药。 方法 本实验应用显色培养基培养的方法初步鉴定阴道念珠菌的菌型,再结合糖的同化及酵解试验鉴定念珠菌,应用E-test方法,对其进行药物敏感性测定。 结果 84株临床株中白念珠菌为62株,热带念珠菌为8株,近平滑念珠菌及克柔念珠菌各4株......


【摘要】  目的 研究阴道炎致病念珠菌性的分型及药物敏感性,指导临床用药。 方法 本实验应用显色培养基培养的方法初步鉴定阴道念珠菌的菌型,再结合糖的同化及酵解试验鉴定念珠菌,应用E-test方法,对其进行药物敏感性测定。 结果 84株临床株中白念珠菌为62株,热带念珠菌为8株,近平滑念珠菌及克柔念珠菌各4株,伪热带念珠菌、高里氏念珠菌及类星形念珠菌各为2株。84株临床株对两性霉素B、酮康唑、伊陷康唑和氟康唑的耐药株数分别为0、10、12、12。 结论 阴道念珠菌以白念珠菌为主;伊曲康唑及两性霉素B的平均抑菌浓度较酮康唑及氟康唑的高;唑类药物之间存在交叉耐药现象。

【关键词】  念珠菌 氟康唑 伊曲康唑 酮康唑 药物敏感性试验

念珠菌是临床常见的条件致病菌,耐药菌株的报道逐渐增多。本实验对阴道念珠菌的菌型进行鉴定,探讨耐药菌珠与菌型之间的关系,指导临床用药。

  1  材料与方法

  1.1  仪器、设备  温箱:中国重庆;冰箱:吉诺尔、中国长春;操净台:苏州安泰空气技术有限公司;显微镜:OLYMPUS。

  1.2  试剂  RPMIl640:长春宝泰克公司;TOBACO琼脂:长春宝泰克公司;MOPS:长春宝泰克公司;ETEST试剂:瑞典倍肯公司;显色培养基:CHROManar公司中国地区部代理博赛科技有限责任公司;酵母样真菌糖同化鉴定管:杭州天和微生物试剂有限公司;酵母样真菌糖酵解实验生化管:杭州天和微生物试剂有限公司;新鲜血清:北华大学医学院附属医院检验室提供;近平滑念珠菌ATCC2201 9: 北京医科大学第一医院赠送。

  1.3  实验方法  标本随机取阴道念珠菌镜检阳性,伴临床症状的患者。每株菌株分别用FL、KE、IT及AP做药敏实验,记录药敏结果。

  1.3.1  阴道念珠菌的鉴定方法

  1.3.1.1  白念珠菌的鉴定

  1.3.1.1.1  显色培养初筛:  将临床标本接种于斜面显色培养基面,经48h孵育后,培养呈现绿色者,初步鉴定为白念珠菌。

  1.3.1.1.2  芽管实验  将初步鉴定为白念珠菌的菌株经沙氏培养基培养24h活化,进一步做芽管实验,进行鉴定,其程序如下:取一滴新鲜血清置于载片上,然后接种少许已活化的菌株,盖上盖玻片,置湿盒中,于温箱中35℃培养3h。取出镜检有芽管形成者即为白念珠菌。

  1.3.1.2  其它念珠菌的鉴定

  1.3.1.2.1  显色培养初筛  将临床标本接种于斜面显色培养基内,经48h孵育后,呈现蓝色者为热带念珠菌,呈现粉色者为克柔氏念珠菌。

  1.3.1.2.2  糖同化及酵解实验  糖同化实验步骤:将待测菌株置于沙氏培养基中培养24h活化。活化的菌株以0.85%的氯化钠溶液制备成0.5麦氏的菌悬液。将糖的同化管打开,每一管分别接种菌悬液200μl,加盖。将糖的同化管置35℃温箱中孵育48h,观察结果。管内混浊生长为阳性。糖的酵解实验步骤:将待测菌株置于沙氏培养基中培养24h活化。活化的菌株以0.85%的氯化的溶液制备成0.5麦氏的菌悬液。将糖的生化鉴定管打开,每一管分别接种菌悬液200μl,紧贴鉴定液面用石蜡封口。将接种的生化管置35℃温箱中孵48h后观察结果。产生气段者为阳性。结合酵母样真菌同化、酵解实验鉴定表查表可得出鉴定结果。

  1.3.2  E-test法检测阴道念珠菌的药物敏感性

  1.3.2.1  E-test药敏检测培养基的制备  按每升溶液中含:RPMIl640固体粉末一袋(含谷氨酰胺,不含碳酸氢钠),吗啉代丙烷磺酸(MOPS)34.53g,葡萄糖20g,TOBACO琼脂15g。其中MOPS为缓冲液,以IN盐酸、IN氢氧化钠调pH为7。注意:RPMll640及葡萄糖溶解后需用0.23μm的滤膜滤过消毒。

  1.3.2.2  E-test药敏实验步骤  接种物制备:从琼脂平板上取经两次活化培养的菌落均匀县浮于0.85%氯化钠溶液中,制备0.5麦氏浊度菌县液。接种技术:以无菌拭子蘸取接种物菌悬液并挤去多余液体。从三个方向均匀涂布以确保整个平板上生长物均匀,至少放置平板干燥15min。E-test加样器放置E-test试剂条于琼脂表面,置入后不准移动,每平板上只放一条。35℃温箱中潮湿孵育48h。观察记录结果:每批试验均应记录质控菌株的药敏结果。

  1.3.3  各种药敏判定标准见  表1。

  1.4  统计学分析  利用两因素方差分析对84株临床株的FL、KE、IT及AP的药敏结果进行分析,见表2。

  表1  E-test试剂抗真菌药物浓度范围及敏感判定标准(略)

  注:S:敏感S-DD:剂量依赖R:耐药   

  以上结果说明各处理因素之间存在显著性差异.再经多个样本均数间的q检验证明FL及KE之间无显著性差异,IT及AP之间也无显著性差异,而FL及KE分别与IT及AP之问存在显著差异。

  2  结果

  2.1  2株临床株菌型分布  84株念珠菌中白念珠菌为62株,占总株数的73.82%。热带念珠菌为8株,占总株数的9.52%,近平滑念珠菌、克柔念珠菌分别为4株,各占总株数的4.76%。伪热带念珠菌、类星形念珠菌、高里氏念珠菌分别为2株,各占株数的2.38%。

  表2  方差分析结果(略)

  2.2  4种抗真菌药物不同浓度下敏感实验结果  见表3。

  2.3  统计分析  经统计分析证明,氟康唑与酮康唑两种药物表3  4种抗真菌药物对84株临床株抑菌结果(μg/ml)药品名称<0.250.5~0.75<1≥11.52~6<8≥812~48  ≥64两性霉素[4]786酮康唑[7]10伊曲康唑66612氟康唑[8]之间平均抑菌浓度无显著性差异,伊曲康唑与两性霉素两种药物之间平均抑菌浓度也无显著性差异。而氟康唑与伊曲康唑、两性霉素之问分别存在显著性差异,酮康唑与伊曲康唑、两性霉素之间也分别存在显著性差异。尽管两性霉素无耐药菌株,但其平均抑菌浓度较高。故不及氟康唑与酮康唑药效。

  3  讨论
   
  念珠菌是临床常见的条件致病菌,抗生素的滥用及免疫抑制剂广泛使用使得念珠菌的感染机会逐渐增加[1]。随着真菌感染率的不断上升,真菌病治疗也面临着严峻的挑战,且有关耐药菌株的报道也逐渐增多[2,3]。本实验采用显色培养基培养,结合常规生化方法对阴道念珠菌的菌型进行鉴定,掌握常见致病念珠菌的类型。并且采用的酵母菌药物敏感性检测方法B-test法测定阴道念珠菌的耐药性,探讨耐药菌珠与菌型之间的关系,指导临床用药。
   
  两性霉素无耐药菌株,但其平均抑菌浓度较高。故不及氟康唑与酮康唑药效。氟康唑对白色念珠菌、热带念珠菌有极好的抗菌活性[4],对治疗真菌感染尤其是念珠菌有重要的临床意义。建议应用氟康唑来治疗念珠性外阴阴道炎。

【参考文献】
    [1] 杨莉莉,范严严,邓英,等. 146株念珠菌的分布及药敏结果分析[J].中华医院感染学杂志,2004,14(6):703~704.

  [2] 沈建箴,吕联煌,余菲菲,等.DNA扩增制备探针并用于临床白色念珠菌感染鉴定[J].中华医院感染学杂志,2004,14(6):616~618.

  [3] 黄长武,李兴禄,邱君凤,等.白色念珠菌在呼吸道中致病性的研究[J].中华医院感染学杂志,2004,14(7):721~2723.

  [4] 傅庆萍,梅亚宁,陈友华.1015株念珠菌感染的病原菌分类和药敏分析[J].中华医院感染学杂志,2005,15(7):1310~1311.


作者单位:吉林北方肝胆医院皮肤性病科,吉林 长春 130062; 北华大学附属医院皮肤科,吉林 吉林 132011


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