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霍乱毒素B亚单位对大鼠结肠炎组织MPO、IL-10水平的影响

来源:中国热带医学 作者:董丹 于稔 2010-1-13
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摘要: 【摘要】 目的 观察霍乱毒素B亚单位对大鼠实验性结肠炎结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)、白介素-10(IL-10)水平表达的影响。 方法 将SD大鼠随机分成四组,采用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠法,制备大鼠实验性结肠炎模型,实验组采用霍乱毒素B亚单位,其剂量为700μg/只,阳性对照药物采用柳氮磺胺吡啶,其剂量为300m......


【摘要】  目的 观察霍乱毒素B亚单位对大鼠实验性结肠炎结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)、白介素-10(IL-10)水平表达的影响。 方法 将SD大鼠随机分成四组,采用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠法,制备大鼠实验性结肠炎模型,实验组采用霍乱毒素B亚单位,其剂量为700μg/只,阳性对照药物采用柳氮磺胺吡啶,其剂量为300mg·kg-1,每天灌胃一次,两周后测定结肠黏膜组织中MPO活性、IL-10含量,观察结肠组织病理学变化。 结果 模型组大鼠结肠黏膜MPO值高于正常组、IL-10值低于正常组(P<0.05)。柳氮组和霍乱毒素组均能降低MPO值和增加IL-10值(P<0.05),较明显改善大鼠结肠组织学损伤。 结论 霍乱毒素B亚单位能够显著降低结肠炎大鼠黏膜MPO活性,提高IL-10水平,对大鼠实验性结肠炎具有缓解或治疗作用。

【关键词】  乱毒素B亚单位 结肠炎 髓过氧化物酶 IL-10

炎症性肠病(Inflanmmatory bowel disease,IBD)是一组原因未明的累及胃肠道的慢性炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(Ucerative colitis,UC)和Crohn病(Crohn,disease,CD)[1],目前认为与遗传、环境、免疫因素有关。免疫耐受的破坏和Th1/Th2功能失衡是其发病的重要环节。Th1细胞能够分泌IL-2、IFN-γ、TNF等;Th2细胞能够分泌IL-4、IL-5、IL-10等,主要表现在两者分泌的细胞因子之间比例失衡,细胞因子之间的比例失衡会进一步加重Th1/Th2失衡,形成一个恶性循环,最终导致疾病发生。其中IL-10是一种抑制炎症因子,其生物学功能是抑制巨噬细胞的活性,从而控制机体局部炎症反应[2]。

  霍乱毒素(Cholera toxin,CT)是霍乱弧菌分泌的一种外毒素,由1个A亚单位(CTA)和5个B亚单位(CTB)组成。A亚单位是霍乱毒素的活性部分,B亚单位的主要功能是通过与哺乳动物小肠上皮细胞上的单唾液酸神经节苷脂GM1结合而使得A亚单位进入细胞[3]。CT-B无毒性而且具有免疫原性,目前对其应用较多的主要是作为佐剂使用,当和其他疫苗一起通过口服或是吸入给药时可以刺激机体产生sIgA和IgG。最近研究较多的就是使用重组CT-B作为免疫调节剂可显著增强免疫耐受性。单独口服重组CT-B(rCT-B)对于肠道黏膜炎症有很好的改善作用[4]。本实验主要想探讨给炎症性肠病大鼠模型口服rCT-B时IL-10、MPO的变化情况,为探讨其发病机制以及治疗提供实验依据。

  1  材料及方法

  1.1  实验动物  SD大鼠24只,雄性,体重180~220g,由辽宁医学院实验动物中心提供。

  1.2  主要试剂和仪器  霍乱毒素B亚单位、5%(W/V)TNBS水溶液(Sigma公司),髓过氧化物酶(MPO)试剂盒(南京建成生物工程研究所),IL-10试剂盒(上海西唐生物科技有限公司),柳氮磺胺吡啶(SASP)(上海福乐制药)。751紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),低温水平离心机(北京医疗仪器修理厂),组织匀浆机(宁波新芝科器研究所),酶标仪(南京华东电子集团),电子天平,显微镜等。

  1.3  IBD模型制备  取健康SD大鼠24只,随机分为4组,每组6只。分别为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组和霍乱毒素组。动物自由饮水但禁食24h后,腹腔注射10%水合氯醛0.3ml/100g体重,大鼠充分麻醉后,将灌肠管用石蜡润滑后经肛门轻轻缓慢插入大鼠体内6~8cm处,将TNBS(TNBS 100mg/kg体重)的50%乙醇溶液缓缓注入大鼠肠道内[5],完毕后提起尾巴倒置2min,正常组注入等量生理盐水。
第2d开始每天早8:00灌胃给药,柳氮磺胺吡啶300mg·kg-1体重,霍乱毒素组700μg于1ml 0.35M NaHCO3中,每日1次,连续2周。正常组和模型组给等量生理盐水。

  1.4  结肠病理组织切片观察  各组大鼠给药治疗2w后,经20%乌拉坦(0.5ml/100g)麻醉后,立即开腹分离结肠,沿肠系膜打开结肠,0.9%冷生理盐水冲洗干净,肉眼取病变组织于10%中性甲醛中固定,经脱水,透明,浸蜡,切片,进行HE染色,最后封固,在显微镜下观察病变结肠形态学改变。

  1.5  结肠粘膜MPO测定  各组大鼠经20%乌拉坦(0.5ml/100g)麻醉后,立即开腹分离结肠,沿肠系膜剪开肠腔,取部分结肠,按试剂盒说明书的方法制备组织匀浆,加入样品和各种试剂,混匀,37℃恒温水浴箱30min,加入显色剂37℃水浴15min,用分光光度计(460nm蒸馏水调零)比色,测定吸光度。按照以下公式计算MPO活力:

  MPO单位/克湿片=(测定管OD值-对照管OD值)/11.3×取样量(g)

  1.6  ELISA方法结肠粘膜IL-10含量  各组大鼠经20%乌拉坦(0.5ml/100g)麻醉后,立即开腹分离结肠,沿肠系膜剪开肠腔,取部分结肠,按照试剂盒说明书的方法制备组织匀浆,再一次加入各试剂,最后在酶标仪450nm处测吸光值,绘制坐标曲线,计算IL-10含量。

  1.7  统计学处理  应用SPSS15.0软件进行统计学分析,结果以(x±s)表示,组间数据采用t检验,P<0.05认为有显著性意义。

  2  结果

  2.1  结肠肉眼及病理组织切片观察  模型组解剖明显可见肠粘连、肠壁有不同程度的增厚,打开肠腔可见水肿、溃疡,坏死等。给药组则水肿减轻,有坏死但未见明显溃疡形成。光镜下,正常大鼠结肠组织结构清晰,黏膜完整、腺体丰富,排列紧密。模型组大鼠结肠黏膜缺损深达肌层、大量炎性细胞浸润,腺体破坏。给药组结肠黏膜有修复但仍不完整,腺体增生尚可见瘢痕组织,表现出明显的治疗作用。

  2.2  大鼠结肠组织中IL-10含量的变化  与正常对照组比较,模型组结肠组织的IL-10含量明显下降(P<0.05);SASP组和CT-B组与模型组比较,能增高IL-10的含量(P<0.05);SASP组和CT-B组比较IL-10含量(P>0.05)(表1) 。

  表1  各组大鼠结肠组织中IL-10含量的变化(略)

  注:&与正常组比较,P<0.05);*与模型组比较,P<0.05);#与SASP比较,P>0.05。

  2.3  大鼠结肠组织中MPO活性的变化  与正常对照组比较,模型组结肠组织的MPO活性明显增加(P<0.05);SASP组和CT-B组与模型组比较,能降低MPO活性(P<0.05);SASP组和CT-B组比较MPO活性(P>0.05)(表1)。

  3  讨论

  在50%乙醇破坏肠黏膜屏障以后,TNBS作为一种半抗原物质,与结肠组织中大分子蛋白结合,成为一种抗原物质,引起机体免疫反应而诱导肠炎的发生。其临床表现为腹泻、血便,病理可见溃疡,大量炎细胞浸润,符合溃疡性结肠炎的诊断。

  IL-10原被称为细胞因子合成抑制因子(CSIF),是活化的Th2细胞产生的一种活性物质,主要抑制Th1细胞的激活和细胞因子的产生,其生物学功能主要是抑制和终止炎症反应,具有很强的抑制巨噬细胞活性作用,另外它还可以强烈的刺激抗原特异性B细胞的增殖和分化,辅助人类B细胞前提的増殖及成熟B细胞活性的激活,影响B细胞转化。当人体受到各种病原体感染时,通过免疫系统产生和维持免疫应答,以清除病原体、控制感染[6]。另一方面也可避免造成一定的自身组织特异性损伤。高效准确的免疫应答应当既能抗御病原体、保护机体,又可避免因免疫应答过度所造成的病理损伤。IL-10是维持这一平衡中的重要因素,因此IL-10的水平可以反应感染的严重程度。

  MPO活性与急性炎症的程度成正相关,MPO主要位于多形核白细胞嗜苯胺蓝颗粒中,其在结肠中的活性与组织中性粒细胞浸润程度呈线性关系,所以可以根据MPO含量多少判断急性期炎症治疗情况[7]。

  因此可以认为CT-B可以有效的控制溃疡性结肠炎的炎症反应,从而达到控制疾病情的治疗作用。虽然CT-B对溃疡性结肠炎的治疗有一定的作用,但是关于溃疡性结肠炎作用机制以及霍乱毒素B亚单位的用药的最佳时间与最佳计量以及应用到临床病人身上还需要进一步研究。

【参考文献】
    [1] Podolsky DK. Inflammatory bowel disease[J]. N Engl Med,2002,347(6):417~429.

  [2] 任大宾,孙仁宇. 白介素210 的抗炎功能及其分子机制[J].国外医学呼吸:系统分册,2005,25(3) :175.

  [3] Holmgren J.Action of cholera toxin the prevention and treatment of cholera[J].Nature,1981,292(5822):413.

  [4] Delgado M,GaneaD.VIP and PACAP enhance the invivo generation of memory Th2 cells by inhibiting peripheral deletion of antigen-specific effectors[J].ArchPhysiolBiochem,2001,109(4):372~376.

  [5] Morris G P,Beck P L,Herride M S,et al. Hapten-induced Model of Chronic Inflammation and Ulceration in the Rat Colon[J]. Gastroenterology,1989,96:795-803.

  [6] 于侠,孙景辉.白介素-10基因多态性与感染性疾病的关系的研究[J].中国优生与遗传杂志,2005,2:7~8.

  [7] Pavlick KP,Laroux FS,Fuseler J,et al. Role of reactive metabohites of oxygen and nitrogen in inflammatory bowel disease[J]. Free Radic Biol Med,2002,33(3):311~322.


作者单位:辽宁医学院,辽宁 锦州 121001; 朝阳县人民医院,辽宁 朝阳 122000


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