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胶乳增强免疫透射比浊法测定抗“O’的方法学评价

来源:中国热带医学 作者:王小敏,王永卿作者单位:1.海口市中医院,海南 海口 2013-9-26

摘要: 【摘要】 目的 本文对胶乳增强免疫透射比浊法定量测定抗“O”进行方法学评价。方法 定量测定抗“O”,并对其线性范围、重复性、相关性实验、干扰实验及试剂稳定性加以评价。结果 线性范围为20~800U/ml。结论 胶乳增强免疫透射比浊法定量测定血清中抗“O”含量,其线性范围宽、重复性好、特异性高、干扰小、操作......


【摘要】    目的 本文对胶乳增强免疫透射比浊法定量测定抗“O”进行方法学评价。方法 定量测定抗“O”,并对其线性范围、重复性、相关性实验、干扰实验及试剂稳定性加以评价。结果 线性范围为20~800U/ml;高、中、低三种浓度的抗“O”批内CV分别为1.74%、1.87%、 1.96%;批间CV分别为2.1%、2.92%、3.52%;平均回收率为99.85%。结论 胶乳增强免疫透射比浊法定量测定血清中抗“O”含量,其线性范围宽、重复性好、特异性高、干扰小、操作简便快速,具有较高的临床应用价值。

【关键词】  胶乳增强免疫透射比浊法;抗“O”(ALSO);测定

  以往检则ASO多采用乳胶凝集法,该方法灵敏度不高,重复性欠佳,受实验环境等因素影响较在,不能满足临床对ASO定量的要求。我们对胶乳增强免疫透射比浊法定时测定抗“O”进行方法学评价,具有较好的临床应用价值。

  1 材料与方法

  1.1  试剂 

  由北京科美东雅生物技术有限公司提供批号为:Lot:060905。

  1.2 仪器 

  日立7600全自动生化分析仪。

  1.3 检测对象 

  正常对照组:健康体检血清30例,年龄5~70岁之间;明确诊断为风湿性疾病患者血清50例,年龄在5~70岁之间;未明确诊断但ASO含量增高的患者血清20例。在进行各组ASO含量检测后,收集分装,并冷冻保存备用。

  1.4 方法

  1.4.1 测定原理 

  利用抗原抗体特异性反应原理测定血清中ASO含量。

  1.4.2 主要参数 

  方法:终点法波长:540nm试剂及样本比例:试剂i1 800μl、试剂ii 200μl、标本20μl。反应时间5min。

  2 实验和结果

  2.1  线性范围 

  配制ASO浓度为1 140U/ml的标准液,与生理盐水比例混合产生20U/ml, 200UIml、400Ulml,800UIml,1 140U/ml 5个浓度。结果显示在20~800U/ml内呈线性。

  2.2 重复性实验 

  取低、中、高3种浓度的ASO血清,作批内和批间实验。结果见表1。表1  ASO的重复性实验结果组别批内xSCV(略)

  2.3 回收实验 

  把ASO含量为463U/ml的血清分成4份,分别加入浓度为57U/ml、142.5U/ml、285U/ml和560U/ml的4个AS0标准液,按原血清2ml,加入标准液0.1ml的比例混和,回收率分别为100.3%,99.8%、99.2%、100.1%,总平均回收率为99.85%。其结果与回收率见表2。表2  回收实验测定结果项目加入样本
浓度(略)

  2.4 相关性实验 
  
  选取50例患者血清,先用乳胶凝集法检测,其中42例为阳性,8例为阴性:再用免疫透射比浊法检测,其中48例为阳性,2例为阴性。通过配对χ2检验,两种方法检测ASO的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且乳胶法检测的42例阳性患者血清比浊法检测全部为阳性,且另6例比浊法检测阳性的标本均值为238.5±29.71,与正常人相比差异有统计学意义(t检验P<0.05),表明免疫透射比浊法对AS0的检出率比乳胶凝集法高。

  2.5 干扰实验

  2.5.1 溶血的干扰 

  取末溶血的标本,测定ASO值,然后用物理方法使标本溶血,离心取上清液,用血常规  仪检测出Hb含量为13.5g/L,再次检测,结果显示Hb为13.5g/L的血标本对AS0的检测有2.2%的干扰,而Hb在10g/L以下,即轻微的溶血对ASO的测定无明显于扰。

  2.5.2  脂血的干扰 

  用乳糜血标本,其中含甘油三脂浓度为14mmol/L,先对其测定ASO 3次取平均值,然后加入一定量特定浓度的ASO标准液,测定3次取平均值进行计算比较,结果显示此浓度的乳糜血对ASO的检测无明显干扰,此时检测标本中甘油三脂的含量为12mmol/L,因此可以认为一般的脂血对ASO的测定不会有干扰。

  2.5.3 黄疸的干扰 

  在ASO 333μmol/L标准液中加入等量浓度为600μmol/L的总胆红素标准液,再测定ASO理论值166.5U/ml,ASO实测值167U/ml,回收率100.3%,胆红素浓度值300U/ml,黄疸血清对ASO的检测无明显干扰。

  2.5.4  类风湿因子(RF)的干扰 

  在ASO浓度333U/ml标准液中加入2份浓度为450U/ml类风湿因子的标准液,测得ASO结果为112.3U/ml,显示浓度为300U/ml风湿因子对ASO的检测有1.2%的干扰,所以认为一般浓度的RF血清对ASO的检测无明显干扰。ASO理论值111U/ml,ASO实测值112.3U/ml,回收率101.2%,类风湿浓度值300U/ml。

  2.6 试剂稳定性 

  将9份ASO-I剂与1份ASO-II试剂混合即成工作液,置于2~8℃试剂箱,用来测定两种浓度的ASO质控液,测定30d,结果CV<5%,说明试剂在2~8℃可稳定30d。

  3 讨论
       
  抗“O”主要是由A组β溶血性链球菌(GAS)感染机体后,体内针对其抗原溶血素O产生的相应的抗体,此抗体即为抗链球菌溶血素O(ASO)[1],简称抗“O”。抗“O”没有保护机体的作用[2],但检测抗“O”值增高提示有过溶血性链球菌感染,可以作为溶血性链球菌感染的间接证据,以及对各种风湿性疾病的预防、诊断、治疗和疗效观察具有重要意义。抗“O”常在GAS感染1wk后开始升高,3~6wk后达到高峰,在6~8wk后开始下降直至逐渐恢复正常[3]。此种抗体水平显著增高与活动性风湿性疾病密切相关,持续存在或水平下降,则提示疾病为非活动期或恢复期,多次检测抗“O”水平对临床的动态监测有重要意义。
        
  以往检测ASO多采用乳胶凝集法,且此方法至今在许多医院仍被采用。然而该方法灵敏度不高,重复性欠佳,受环境及个体差异等影响因素较大,且不能定量[4],不能满足临床对 ASO定量的要求,随着检验医学的发展,该方法己逐渐被免疫比浊法所取代。

    免疫比浊法、乳胶凝集法和ELISA一样存在免疫学中的抗原或抗体过剩引起的钩状效应,即前带或后带现象。为了防止和尽量减小钩状效应的影响,对高出线性范围以外的标本可以进行前稀释。但反应的测定范围依赖于样品试剂比,减少样品量可提高测定范围,但会相应的降低反应的灵敏度,有时也会导致Aso抗体含量过低造成抗原绝对过量,影响测定结果的准确性[5]。因此务实验室应根据自己的不同准确设置相应的参数,且根据标本浓度的不同对其进行不同比例的稀释,以尽量减少各种误差影响,确保测定结果的可靠性。
       
  本实验较好的把胶乳增强免疫透射比浊法和生化分析仪结合在一起,定量检测血清中 ASO含量,其特异性高,重复性好,检测灵敏度高,线性范围宽,自动化程度高,操作简便快速。与胶乳凝集法半定量测定比较,具有快速、简便、准确、干扰小的优点。从实验可以看到,Hb≤10g/L,甘油三脂≤12.5mmol/L,胆红素≤333μmol/L时对ASO的测定无明显干扰。相关实验表明免疫比浊法测定ASO的检出率比乳胶法高。完成一次测试只需要10min左右,本法准确度和精密度高,批内CV<1.96%,批间CV/<3.5%,平均回收率为99.85%。

【参考文献】
    [1]贾向新,何云荣,丁旭.ASO滴度对临床诊断价值探讨[J].白求恩大学学报,1996,22(2):156.

  [2]刘李兴福,张妮.急性风湿热诊断的相关问题[J].临床内科杂志,2005,LO(22):652~654.

  [3]高路,袁越.链球菌感染后风湿热和风湿性心脏病[J].临床儿科杂志,2006,24(6):461~463.

  [4]张颖,王艾丽,江舟,等.三种检测抗链球菌溶血素方法的比较[J].医学研究生学报,2001,4(14):54~55.

  [5]刘忠民,高月亭,陈涛.自动生化分析仪器自动识别免疫比浊分析中的钩状效应[J].现代临床医学生物工程学杂志,2002,6(4):253.


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