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大鼠干细胞移植对四氯化碳所致大鼠肝硬化的影响

来源:中国热带医学 作者:徐献忠,陈斌,倪勇 2010-1-13
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摘要: 【摘要】 目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 移植对四氯化碳诱导所致的肝硬化大鼠肝纤维化的影响。方法 首先行大鼠MSCs的分离、纯化及扩增。实验动物随机分为对照组和肝硬化组,肝硬化组采用60%的四氯化碳(CCl4)皮下注射8周,然后肝硬化组再随机分成MSCs对照组和MSCs移植组及8周肝硬化组。MSCs 移植组经门静脉注......


【摘要】    目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 移植对四氯化碳诱导所致的肝硬化大鼠肝纤维化的影响。方法 首先行大鼠MSCs的分离、纯化及扩增。实验动物随机分为对照组和肝硬化组,肝硬化组采用60%的四氯化碳(CCl4)皮下注射8周,然后肝硬化组再随机分成MSCs对照组和MSCs移植组及8周肝硬化组。MSCs 移植组经门静脉注射MSCs入大鼠肝内,4周后处死所有大鼠,行肝功能检测、肝脏免疫组化检查和HE染色的病理检测。结果 MSCs经门静脉移植肝硬化大鼠后,其血清碱性磷酸酶(ALP)及谷丙转氨酶(ALT)含量明显下降及血清白蛋白(ALB) 和胆固醇(CHO)含量明显升高。病理检查结果示MSCs 移植组肝内胶原纤维增生程度明显减轻,尽管假小叶仍然存在,但小叶周围和小叶内的胶原纤维明显减少,小叶中还出现了较多形态正常的肝细胞。结论 MSCs 可能在肝硬化大鼠体内分化成为具有肝样细胞的功能,并改善了肝硬化大鼠的部分肝功能及肝脏的部分病理结构,为今后临床行干细胞移植治疗肝硬化提供了实验依据。

【关键词】  骨髓间充质干细胞;移植;肝硬化

  Study the effect of transplant with bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) on the rat liver fibrosis model induced by  carbon tetrachloride (CCl4).

  XU Xian-zhong,CHEN Bin,NI Yong

  1.Department of Hepatobiliary Surgery, the Fourth People's Hospital of Changde, Changde 415000, Hunan Province. P. R. China;

  2.Shenzhen Municipal Second  People's Hospital , Shenzhen 518035,Guangdong, P,R. China
   
  Abstract:Objective  To study the effect of transplanted MSCs on the rat liver fibrosis in carbon tetrachloride (CCl4 )-induced hepatocirrhosi  Methods  Rat MSCs was isolated in vitro , purified and amplified. Experimental animals were randomly divided into control group and hepatocirrhosis groups. Rats in hepatocirrhosis group were subcutaneously injected with 60 % CCl4 for 8 weeks,  then subdivided into MSC control group, MSC transplanted group and 8 weeks hepatocirrhosis groups . MSCs were injected into the portal vein in rats in MSC transplanted group. All of rats were killed 4 weeks after injection and their hepatic function were examined.  The degree of liver cirrhosis was observed by immunohistochemistry and pathological examination after stained with HE.  Results  The levels of plasma ALB and CHO were on the increase and Plasma ALP and ALT on the decrease in MSC transplanted groups. In hepatocirrhosis rats aged 8 weeks, a large amount of hyperplastic collagenous fiber was presented in liver tissue and the frame of the pseudolobuli was formed.The amount of hyperplastic collagenous fiber in rats of MSC- transplanted group was significantly lower than those of the 8-week hepatocirrhosis and MSC control groups.  Conclusion  MSCs may be differentiated into hepatocyte in hepatocirrhosis rat. Liver fibrosis and hepatic function of hepatocirrhosis rats transplanted with bone MSCs are improved partly .The experimental results can provide evidence for treatment of liver cirrhosis.
   
  Key words:Mesenchymal stem cells; Transplantation;Liver; Cirrhosis

    近年来发现骨髓干细胞在一定条件下经体内外诱导可以定向分化为肝样细胞,有望成为治疗终末期肝病的新型种子细胞[1]。本研究通过将骨髓间充质细胞移植入经四氯化碳诱导所致肝硬化大鼠肝脏,观察移植前后肝脏纤维化的病理改变及肝功能改变情况,为骨髓间充质干细胞治疗肝硬化提供实验依据。

  1  材料与方法

  1.1  主要试剂及仪器 

  低糖DMEM培养基(Gbco)、10%胎牛血清(杭州四季清)、四氯化碳液(广州)、胰蛋白酶(Invitrogen,美国)、Percoll(Phanmacia,比重1.077g/L)、TRIzol细胞裂解液(Invitrogen,美国)、倒置相差显微镜(Olympus)、细胞培养箱(Forma)、流式细胞仪(FACSCalibur)。CD29、CD34、CD44及CD45单克隆抗体(Lab vision,美国)。

  1.2  实验动物 

  纯系SD雄性大鼠,3周龄(供体大鼠);成年纯系SD雄性大鼠,鼠龄2+月,体重(250±20)g(受体大鼠);由南方医科大学实验动物中心提供。

  1.3  MSCs的分离、纯化、培养 

  取3周龄大鼠,无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨,DMEM冲洗胫骨及股骨骨髓,将骨髓液制成单细胞悬液,用密度为1.077g/L的percoll单核细胞分离液分离离心2 000rpm,10min,吸取中间的白膜层,用PBS冲洗2次后,以2×105/ml密度接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基(不含抗生素),置于5%CO2 、饱和湿度37℃培养箱。4~5d首次换液,以后每3d换液1次,8~12d细胞生长融合达80%以上,以0.25%胰蛋白酶消化,按1传3比例传代培养。

  1.4  MSCs的鉴定 

  取第3代细胞,胰酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成105/ml单细胞悬液,用不含钙、镁的磷酸盐缓冲液离心洗涤2次后,用同样的磷酸盐缓冲液调整细胞浓度为1×106/ml和5×105/ml备用,分别用流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45的阳性表达和细胞移植。

  1.5  肝硬化模型构建和分组及MSC移植 

  实验选用成年纯系SD雄性大鼠,随机分为对照组(n=10)和肝硬化组(n=30)。对照组皮下注射生理盐水,肝硬化组每周一、五皮下注射60%的四氯化碳-大豆油,剂量是0.3ml/100g,8周后随机处死10只大鼠,设定为肝硬化组。 肝硬化组余下20只大鼠随机分为MSC移植组(n=10)及MSC对照组(n=10),MSC移植组经门静脉注射2×105MSC,MSC对照组经门静脉注射0.5ml 生理盐水,在移植后的四周时间中,继续皮下注射60%的四氯化碳-大豆油,剂量0.15ml/100g。移植4周后处死大鼠。

  1.6  血生化指标的检测 

  大鼠麻醉后开腹取下腔静脉血2ml,检测白蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、胆固醇等。

  1.7  组织病理学观察 

  大鼠麻醉抽血后处死大鼠首先观察肝脏的大体改变及肝脏的重量,然后行免疫组化检查及HE病理学检查。

  2  结果

  2.1  MSCs的形态学特征 

  原代培养中细胞为分散、克隆集落方式增殖;当相邻集落融合成片达80%以上,细胞排列呈漩涡状,细胞间的界限不清,细胞呈长梭状。此外,还存在少数的小圆细胞。传代后,细胞不以集落形式生长,而是均匀分布长梭形细胞平均生长,杂质细胞明显减少,MSC纯度升高。见图1。

  2.3  肝功能生化指标 

  肝硬化对照组、MSCs假移植组和MSCs移植组的血清ALP及ALT含量明显高于对照鼠(P<0.05)。MSCs移植组的血清ALB和CHO含量与对照鼠相近(P>0.05),与肝硬化组和MSCs假移植组相比明显升高(P>0.01) ;血清ALP含量也出现了明显的下降(P<0.05)。说明肝硬化对照组、MSCs假移植组和MSCs移植组均有肝功能异常,在移植MSCs 4周后,MSCs移植组大鼠的某些肝功能得到改善。见表1。表1  实验各组间肝功能指标比较(略)

  2.4  大鼠的一般状况及肝脏的肉眼形态
 
  对照组大鼠的肝脏呈紫红色,分多叶,边缘薄锐, 表面湿润光滑;肝硬化对照组大鼠的体重明显降低,其肝脏明显增大,约为正常时的1.5 倍,呈不均匀的暗红色,边缘钝圆,表面可见很多细小结节; MSCs假移植组的体重较8周肝硬化组稍减轻,肝脏重量增至正常2 倍左右,呈不均匀苍白色,表面可见很多较均匀结节;MSCs移植组的体重明显增加并接近于正常,其肝脏仍明显增大,重量是正常时的2倍左右,呈较均匀暗紫色,表面变得较为光滑。

  2.5  肝脏的病理学检查 

  免疫组织化学显色后发现,仅在MSCs移植组的大鼠肝中发现少量散在棕黄色细胞,分布在中央静脉和其他血管周围,大小形态同周围肝细胞相似。在HE染色的肝组织切片中,对照大鼠的肝小叶清晰,汇管区和中央静脉的周围见少量胶原纤维。肝硬化对照组大鼠肝内胶原纤维在被膜下、汇管区和中央静脉区的增生明显,相互联接形成假小叶,形成肝硬化病理表现,见图3。MSCs假移植组的肝病理表现与8周肝硬化组相似。同MSCs对照组对比, MSCs移植组肝内胶原纤维增生程度减轻,假小叶虽还存在,但小叶周围和小叶内的胶原纤维减少,并可见部分正常肝细胞,见图4。

  3  讨论
   
  肝硬化以往被认为是一种难以逆转的不可治愈的病变,而目前的组织工程技术可能成为治疗肝脏不可逆损伤的新途径,研究证明,移植少量干细胞,可以在特定的微环境中通过体内增值达到以下目的[2~4]:①纠正先天性代谢缺陷;②辅助肝功能好转;③代替损伤的肝实质。骨髓干细胞的移植不仅在于替代肝细胞移植,还可以在早期利用骨髓修复肝损伤。
  
  CCl4是使用最早、最广泛的肝纤维化诱导剂[5]。CCl4诱导肝损伤的机理是直接损害肝细胞,破坏细胞的各种成份,造成肝细胞的脂肪变性与坏死,形成坏死后肝硬化。本实验采用CCl4与大豆油混合成60%的浓度,每周皮下注射两次,在第8周大鼠肝的广泛区域观察到了假小叶。但应用CCl4造成的肝细胞损伤,停药后肝细胞可通过增殖自行修复受损的肝脏,影响了干细胞移植治疗肝硬化的疗效观察,因此本实验采用8周肝硬化后继续半量注射CCl4对抗增值修复, 结果在大鼠体重、肝重、肝纤维化程度及肝功能指标方面,8周肝硬化组与MSCs对照组之间无明显差异。因此本实验中采用半量CCl4来对抗受损肝脏通过增值来自行修复是可行的。
   
  骨髓中的干细胞分为两种,造血干细胞和间充质干细胞。这两种细胞在特定条件下均可向肝细胞转化,并都有强大的增值能力、取材容易、损伤小、便于移植等优点。造血干细胞技术目前已经比较成熟并在临床上已经广泛应用。但近年来发现骨髓MSC有更强的自我更新能力,多项分化潜能及取材更方便等优点,2005年Sato[6]研究表明,骨髓MSC在干细胞移植方面是更为理想的种子细胞。我们以前的研究表明,骨髓MSC在特定的微环境中能分化、增值为肝样细胞。本研究我们通过骨髓MSC分离、纯化、增值后流式细胞仪检测CD29及CD44表达阳性,CD34及CD45表达阴性,说明符合骨髓MSC的特性。
   
  MSCs移植4周后,我们观察到MSCs移植组的血清ALP及 ALT含量明显的下降,血清ALB及CHO明显升高。MSCs 移植组肝内胶原纤维增生程度明显减轻,尽管假小叶仍然存在,但小叶周围及小叶内的胶原纤维明显减少,小叶中还出现了较多形态正常的肝细胞。同时我们在MSCs移植组大鼠肝中观察到了抗EGF2R单抗的细胞,这说明移植的MSCs 已在肝硬化的大鼠肝内存活。说明了MSCs能在肝硬化大鼠体内分化成肝样细胞,并能改善肝硬化大鼠的部分肝功能及肝脏的部分病理结构。
   
  本实验结果虽然初步表明植入的MSCs能部分改善肝脏功能及病理结构的作用,但是作用机制还不十分明确,目前认为:①MSCs在肝硬化的微环境中转化为肝样细胞发挥作用;②MSCs本身具有部分肝细胞功能;③MSCs在微环境中诱导产生生长因子发挥作用;④MSCs与体内肝细胞融合重新编排成肝细胞发挥作用。这些还需要进一步的研究。

【参考文献】
    [1]Roy CJ, Fox ll.Hepatocyte transplantation for the treatment of human disease[J]. Semin liver Dis, 1999,19:39~48.

  [2]Sundback CA, Vacanti JP. Alternatives to liver transplantation from hepatocyte transplantation to tissue-engineered organs[J]. Gastroenterology, 2000,118(2):438~442.

  [3]Storm SC, Chowdhury JR, Fox IJ. Hepatocyte transplantation for the treatment of human disease[J]. Semin liver Dis, 1999,19(1):39~48.

  [4]Song E, Chen J, Min J,et al. Fasl expression of splenocytes and its correlation with hepatocytic apoptosis during inteasplenically allogeneic hepatocyte transplantation[J]. Asia J Surg, 2000,23(2):163~168.

  [5]Procto E, Chatamra K. High yield micronodular cirrho sis in the rat[J]. Gastroenterology, 1982, 83:1183~1190.

  [6]Sato Y, Araki H, Kato J, et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion[J].Blood, 2005,106(2):756~763.


作者单位:1.常德市第四人民医院肝胆外科, 湖南 常德 415000;2.深圳市第二人民医院肝胆外科, 广东 深圳 518000.


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