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隐孢子虫对小鼠树突状细胞功能的影响

来源:中国热带医学 作者:王辉 周伯平 杨桂林 陈心春 乐晓华 刘艳 张路坤 Saul 2010-1-13
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摘要: 【摘要】 目的 探索隐孢子虫对小鼠树突状细胞功能的影响。 方法 采用磁珠分离小鼠的树突状细胞,将树突状细胞与活体隐孢子虫一起培养,用流式细胞仪观察树突状细胞表面标记的变化,并进一步观察树突状细胞产生各种细胞因子的情况。 结果 活体隐孢子虫能直接感染小鼠树突状细胞,并使其细胞表面高表达CD40、CD8......


【摘要】  目的 探索隐孢子虫对小鼠树突状细胞功能的影响。 方法 采用磁珠分离小鼠的树突状细胞,将树突状细胞与活体隐孢子虫一起培养,用流式细胞仪观察树突状细胞表面标记的变化,并进一步观察树突状细胞产生各种细胞因子的情况。 结果 活体隐孢子虫能直接感染小鼠树突状细胞,并使其细胞表面高表达CD40、CD80、CD86,同时产生大量的IL-6、IL-12及TNF-α等细胞因子。 结论 树突状细胞参与了隐孢子虫宿主免疫过程,并在宿主对虫体的免疫反应中起重要作用。

【关键词】  隐孢子虫 树突状细胞 免疫反应 胞因子

  Investigation into effect of Cryptosporidium parvum on murine myeloid dendritic cells.

  WANG Hui, ZHOU Bo-ping, YANG Gui-lin, et al.

  (Shenzhen Municipal Donghu Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong, P.R.China)
   
  Abstract:Objective  To investigate the effects of C.parvum infection on murine myeloid dendritic cells.   Methods  Mouse bone marrow-derived DC(BMDC) were selected by immunomagnetic microbeads and cultured with the heat-killed or live C. parvum, respectively. The phenotypic and cytokine secretion response of BMDC to C. parvum infection were analyzed by flow cytometry.  Results  Infection of BMDC with live C. parvum resulted in up-regulation of CD40,CD80 and CD86 expression on the cellular membrane and production of large quantity of a series of cytokines included IL-6,IL12 and TNF-α.
  Conclusion  Murine DCs can be infected by C. parvum, The interaction of activation of DCs plays an important role in initiating both innate and adaptive immune responses against C. parvum.
   
  Key words:C. parvu; Dendritic cells; Immune response; Cytokine

  人隐孢子虫(C. hominis,)和小球隐孢子虫(C. parvum)是与人类疾病有关的生物,是世界上引起急慢性胃肠炎的最严重的肠道原虫[1~2]。特别是对有免疫缺陷的宿主,如艾滋病患者,隐孢子虫病能导致高度威胁生命的持久性腹泻和消瘦,而对这于这种与免疫缺陷相关的机会性感染,当前并没有有效的针对性治疗和预防措施[2]。因此,宿主自身的免疫防御在感染恢复和随后的保护性免疫中有着重要作用,而树突状细胞(DendriticCells,DCs)在识别和应答多种入侵病菌中起着关键作用,是启动天然免疫和获得性特异性免疫的关键元素,但目前国内外对DCs在人隐孢子虫入侵而导致的应答反应中所起的作用还不清楚。因此,本研究的目的就是探索隐孢子虫(C. parvum)直接感染DCs的具体过程以及进一步观察隐孢子虫感染DCs后,DCs出现的包括表型、功能和基因应答反应,探讨DCs在隐孢子虫感染免疫产生中的作用。

  1  材料与方法

  1.1  小鼠DC细胞的获取  取BALB/c小鼠(Jackson Lab,美国)胫骨与腓骨的骨髓,在除去红细胞后,将剩余的细胞与GM-CSF和IL-4共同培养6~7d,在培养的第3d和第5d更换培养液,7d后用CD11c+单抗标记的磁珠分选小鼠的骨髓来源的DC(bone marrow-derived DC,BMDC),然后用流式细胞术确定其表面标记。

  1.2  灭活  (heat killed,HK)和活体(live)隐孢子虫的准备将隐孢子虫悬浮于含有0.8%的牛磺胆酸脂的PBS中在37℃孵育30min后检测隐孢子虫子孢子的脱囊率应大于80%, 在开始实验前,所有的隐孢子虫子孢子必须放在新鲜的漂白液中灭菌7min,然后用PBS洗3次。需要灭活的隐孢子虫子孢子则需放入PBS缓冲液中65℃,30min。

  1.3  隐孢子虫与DC细胞的共同培养及隐孢子虫的标记  将隐孢子虫悬浮于含有0.8%的牛磺胆酸脂的PBS中,37℃孵育15min,然后加入10uM隐孢子虫特异性的荧光染料(CFSE,carboxyfluorescein diacetate succinimidyl esters)再孵育15min。用冰PBS洗3次子孢子体后在荧光显微镜下观察,然后上流式细胞仪检测。

  1.4  流式细胞术对DC表面标记与细胞内细胞因子的检测  流式细胞仪采用美国BD公司的FACSC Calibur,流式图分析采用CellQuest (BD Biosciences)软件;带有荧光标记的单克隆抗体全部购于美国BD Pharmingen公司,它们是抗IL-6、IL-12、TNF-α、CD11b、CD11c、CD8α、B220、CD40、CD80、CD86。细胞外染色方法:每管取2×105细胞,用PBS洗一遍,然后加入FcR-封闭抗体孵育5min,再加入有荧光标记的单克隆抗体4℃孵育30min后上机。细胞内因子的染色方法:每管细胞中加入20uM的Brefeldin A培养至少12h,然后根据相关试剂盒的操作步骤,对细胞进行固定与破膜,再加入荧光标记的单克隆抗体室温下孵育15min,最后用PBS洗一遍,加入含有1%多聚甲醛的PBS后上机分析。

  2  结果

  2.1  小鼠DC细胞表面标记的检测  按方法1.1分选出来的BMDC,用荧光标记的单抗CD11c、CD11b、CD8α、B220染色,发现我们分离的BMDC98%高表达CD11c和CD11b,而不表达CD8α、B220。抗原标记符合骨髓来源的DC细胞表面标记特征,见图1。

  图1  在与GM-CSF和IL-4一起培养7d后,BMDC高表达CD11c和CD11b(黑线所示)(略)

  2.2  隐孢子虫感染小鼠DC细胞  将活体隐孢子虫与BMDC细胞分别按2.5:1、5:1或10:1的浓度一起培养24h,然后按步骤1.3对隐孢子虫进行特异性荧光染色,在荧光显微镜下看见可明显观察到发荧光的子孢子,见图2。

  图2  用CFSE荧光染料染色的隐孢子虫图3  热灭活和活体隐孢子虫对BMDC的感染情况(略)
   
  为了进一步观察不同浓度梯度的隐孢子虫对BMDC的感染率,我们分别用热灭活和活体隐孢子虫与BMDC共同培养24h,以排除虫体与细胞表面的非特异性结合,再用CFSE荧光染料染色,发现在混合培养浓度为10:1时,活体隐孢子虫直接感染BMDC的感染率最高,达到接近20%的水平。而同时热灭活的隐孢子虫对BMDC的感染率却维持较低水平见图3。

  2.3  隐孢子虫对DC细胞表面标记的影响  用活体隐孢子虫10:1浓度感染小鼠BMDC后,取感染了活体隐孢子虫的BMDC,检测其表面标记的表达情况,发现活体隐孢子虫的感染上调了DC细胞的CD40、CD80、CD86的表达水平。见图4。

  图4  活体隐孢子虫对BMDC表面标记影响流式细胞仪直方图,灰色部分代表未受隐孢子虫感染的BMDC表面标记表达情况,黑线代表隐孢子虫感染后BMDC表面标记的表达情况。(略)

  2.4  活体隐孢子虫诱导DC细胞产生高水平的细胞因子  活体隐孢子虫感染BMDC后,我们发现活体隐孢子虫会促进BMDC产生高水平的细胞因子,如IL-6、IL-12及TNF-α等。见图5。从图5中不难发现,活体隐孢子虫感染后BMDC产生的细胞因子显著高于未感染的BMDC。提示隐孢子虫感染能诱导BMDC细胞的激活,从而启动针对隐孢子虫感染的获得性免疫应答。

  图5  隐孢子虫感染后BMDC产生细胞因子的情况,左图为未感染隐孢子虫的BMDC产生细胞因子的情况,右图示被活体隐孢子虫感染的BMDC产生细胞因子的情况。(略)

  3  讨论
   
  众所周知,DCs是最有效的抗原呈递细胞(APC),在激发天然和获得性免疫应答过程中起着重要作用[3]。分布在组织和器官中不同类型(heterogenic)的DCs,在防御病原体入侵中扮演着 “哨兵”的角色[4]。DCs依靠可结合病原虫相关分子的形式识别受体来识别病原虫[5~6]。受体及其配体的连接可导致DCs的激活,DCs的激活以共刺激分子、细胞因子和化学因子的上调为特征,其激活可导致针对病原体的天然和获得性免疫应答的启动[7~8]。据我们了解,目前国内外还没有相关DCs和隐孢子虫感染的研究报道。
   
  本研究发现活体隐孢子虫可以直接感染小鼠BMDC细胞,而且能激活DC细胞,使其趋向成熟,并分泌大量的细胞因子,提示BMDC细胞的免疫反应在诱导宿主(小鼠)对寄生虫免疫中起重要作用。目前,我国艾滋病呈快速流行的趋势,艾滋病患者不断增加,而在艾滋病机会性感染中隐孢子虫被确认为是艾滋病患者合并机会性感染的重要致病病原因素之一, 据国外研究报道在人类免疫缺陷病毒抗体阳性且伴有腹泻患者中隐孢子虫感染率高达48 %[9],而且隐孢子虫感染已被列为艾滋病患者的常规检测项目。但该病目前尚无行之有效的治疗方法。因此,机体先天性和获得性免疫在隐孢子虫感染及康复过程中所起的作用就显得十分重要。本研究结果提示,DCs可以依靠结合病原虫相关分子的形式来识别病原虫受体,通过受体及其配体的连接可导致DCs的激活,其激活可导致机体针对病原体的天然和获得性免疫应答的启动,所以进行隐孢子虫对人体DC细胞功能的影响研究显得尤为重要。

 

【参考文献】
    [1] Chen, XM, Keithly JS, Paya CV, et al. Cryptosporidiosis[J]. N Engl J Med, 2002, 346(22): 1723~1731.

  [2] Tzipori S, Ward H. Cryptosporidiosis: biology, pathogenesis and disease[J]. Microbes Infect, 2002, 4(10): 1047~1058.

  [3] Banchereau, J, F. Briere, et al. Immunobiology of dendritic cells[J]. Annu Rev Immunol, 2000.18: 767~811.

  [4] Reis e Sousa, C. Dendritic cells as sensors of infection[J]. Immunity, 2001.14(5): 495~498.

  [5] Takeda, K, T. Kaisho, et al. Toll-like receptors[J]. Annu Rev Immunol, 2003.21: 335~376.

  [6] Iwasaki, A. and B. L. Kelsall. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine[J]. J Exp Med, 2000. 191(8): 1381~1394.

  [7] McDonald, V. Host cell-mediated responses to infection with Cryptosporidium[J]. Parasite Immunol. 2000,22(12): 597~604.

  [8] Shortman K, Liu YJ. Mouse and human dendritic cell subtypes[J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2(3): 151~161.


作者单位:深圳市东湖医院,广东 深圳 518020; 美国Tufts大学, Medford, MA 02155.


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