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AML-M5b外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖特点

来源:中国热带医学 作者:张玉平,王彩霞,许艳丽,王汉平,王顺清,杜庆华,莫文健, 2010-1-13
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摘要: 【摘要】 目的 研究AML-M5b患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖特点,并分析分选的患者T细胞经体外诱导、活化及短期培养后其TCR Vβ亚家族的利用及克隆性增殖情况。 方法 运用RT-PCR-基因扫描技术分析初治AML-M5b患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族利用和克隆性增殖,免疫磁珠分选患者T淋巴细胞,体外利用自......


【摘要】    目的 研究AML-M5b患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖特点,并分析分选的患者T细胞经体外诱导、活化及短期培养后其TCR Vβ亚家族的利用及克隆性增殖情况。 方法 运用RT-PCR-基因扫描技术分析初治AML-M5b患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族利用和克隆性增殖,免疫磁珠分选患者T淋巴细胞,体外利用自体白血病DC细胞联合CD3单抗、CD28对T细胞进行诱导、活化,并对诱导后T细胞进行TCR Vβ亚家族表达和克隆性增殖分析。 结果 9例患者T细胞在体外获得增殖,TCR Vβ分析显示患者外周血T细胞均表达部分Vβ亚家族,体外诱导前后的T细胞TCR Vβ亚家族表达和克隆性增殖特点不完全相同,有部分出现新的Vβ亚家族表达及克隆性增殖,有部分Vβ亚家族在诱导前后始终表现为克隆性增殖,体外杀伤性分析发现诱导后的T细胞对自体白血病细胞具有一定的识别作用。 结论 AML-M5患者TCR Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布和克隆性增殖,部分Vβ亚家族T细胞在诱导前后始终保持克隆性增殖状态,可能是机体针对白血病相关抗原的特异性CTL,体外诱导活化及短期培养后患者T细胞TCR Vβ亚家族表达数量增加,并出现新的克隆性增殖Vβ亚家族T细胞,提示体外诱导活化能够产生白血病患者自体的白血病特异性CTL。

【关键词】  急性单核细胞白血病 Vβ亚家族 克隆性增殖 基因扫描

  Expression of TCR V·β repertoire and clonal proliferation of activated T-cells in vitro from initially diagnosed leukemic patients(AML-M5b).

  ZHANG Yu-ping, WANG Cai-xia, XU Yan-li, et al.

  (Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong, P. R. China)
   
  Abstract:Objective  To investigate the distribution and clonality of receptor (TCR) Vβ repertoire of the T-cells in initially diagnosed leukemic patients(AML-M5b) and analyze their clonal expansion when it activated in vitro by autologous leukemic dendritic cells.  Methods  By using the RT-PCR, the application of TCR Vβ repertoire was analyzed in T-cells from 9 leukemic patients. The CDR3 size of the detectable TCR Vβ subfamily was further determined by Genescan technique to evaluate the clonality of T cells. T cells were sorted from peripheral blood of the patients by immunomagnetic beads and activated in vitro stimilated by autologous leukemic dendritic cells combining anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. And then the features of TCR Vβ subfamilies and its clonal characteristics of induced T cell were further analyzed.  Results  The restrict distribution TCR Vβ subfamily was found in all 9 patients. Clonal T-cell proliferation has been found in most cases investigated. T-cells from peripheral blood of initially diagnosed patients could be amplified 50~100 times in vitro. Both different expression of Vβ subfamilies and their clonal proliferation were partly observed before and after induction. Clonal expantion of the same TCR Vβ subfamilies was also found before and after induced in some patients. There were also new clonal proliferation of TCR Vβ subfamilies in induced and activated T-cells. T-cells activated in vitro could differentiate the autologous leukemic cells.  Conclusion  There is an obviously clonal proliferation of TCR Vβ subfamilies in leukemic patients(AML-M5b) which may be the specific reaction of the body to leukemia-associated antigens. The clonal proliferation can be efficiently induced by autologous leukemic dendritic cells with the combination of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies in vitro. In patients with leukemia, autologous leukemic specific CTLs may also be produced by leukemic cells.
   
  Key words:TCR Vβ repertoire; T-cell clonal expansion; AML-M5b; Leukemia associated antigen

  由于免疫细胞具有自动识别异己抗原(包括恶性转化的突变克隆肿瘤细胞)的特点,可以敏感的追踪、识别并杀伤少量残留的肿瘤细胞,在清除微小白血病等方面具有天然的优势。在传统的化疗等治疗的基础上联合应用过继性细胞免疫治疗,有可能提高白血病的预后。与供者淋巴细胞输注等非特异性细胞免疫治疗相比,特异性细胞免疫治疗具有副作用小,针对性强等优势,是过继性细胞免疫治疗的研究方向。
   
  本研究利用白血病DC细胞结合CD3、CD28单抗体外活化AML-M5b患者自体外周血T细胞,诱导产生白血病特异性细胞毒性T细胞(CTL),进一步利用RT-PCR-基因扫描研究AML-M5患者自体T细胞经体外诱导、扩增前后,各TCR Vβ亚家族的优势利用情况及其克隆性增殖特点。

  1  材料和方法

  1.1  病例选择  初诊AML-M5b共9例,平均年龄40.4岁(33~72),男5例,女4例。形态学诊断按照FAB分型标准,所有病例细胞免疫分型CD14、CD33、CD13、CD64、CD34、HLA-DR均阳性表达。

  1.2  细胞培养

  1.2.1  细胞分选  于患者初诊时无菌留取外周血,淋巴细胞分离液(1.077)分离单个核细胞(MNC),以1×107/mlMNC提取RNA。免疫磁珠(Miltenyi,German)阳性分选患者初诊时外周血MNC,获得CD3+T淋巴细胞,负分选获得白血病细胞。

  1.2.2  白血病DC细胞诱导  2×106/ml白血病细胞以Stem span加IL-4 400ng/ml、GM-CSF 500ng/ml培养48~72h,再加入TNF-α,继续培养共5d,获得白血病DC细胞[1,2]。

  1.2.3  T淋巴细胞培养及诱导[2~7]  分选后的T细胞1×106/ml于d1加入CD3单抗和CD28单抗各10ng/ml的AIM-V培养液(Invitrogen公司),d3开始加入IL-2 20U/ml,d3开始每隔5d加入丝裂霉素 (MMC 50μg/ml,Sigma)或经照射(25Gy)处理的自体白血病DC细胞,共3个刺激周期,根据生长状况,每隔3~5d半量换液(含IL-2 20U/ml)。培养4W后留细胞提取RNA。

  1.3  T细胞克隆性分析[3~5]

  1.3.1  RNA提取和cDNA合成  所收集的患者MNC和培养细胞按常规方法应用TRIZOL试剂盒(Gibco)方法(异硫氰酸胍法)提取RNA,并应用随机引物和SurperScriptⅢ(Gibco)合成cDNA。

  1.3.2  RT-PCR  以24个TCR Vβ亚家族基因设计相应的特异性上游引物,并在Cβ区设计一下游引物。PCR按常规方法进行,总反应体系25μl,其中含任一Vβ引物(24个Vβ亚家族之一)和Cβ引物0.5μmol/L,dNTP 0.1mmol/L,GOtaq DNA聚合酶1.25U(Promega),10×PCR缓冲液[10mmol/L Tris-HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2及0.001%明胶],dH2O和1μl cDNA产物,同时设阳性和阴性对照。反应在PCR扩增仪中进行,共进行40个循环,其中解链温度94℃,1min(首次为3min);退火温度60℃,1min;延伸温度72℃,1min(末次为10min)。PCR产物于2.5%琼脂糖中电泳分析结果。

  1.3.3  标记PCR产物(Run-off reaction)  RT-PCR产物经电泳分析出现阳性带者进一步以荧光素(5-carboxyfluorescein)标记的Cβ-Fam下游引物进行不对称扩增,得到荧光素标记的单链PCR产物。总反应体系为10μl,含2μl首次PCR产物,Cβ-Fam 0.1μmol/L,MgCl2 2.5mmol/L,dNTP 0.2mmol/L,PCR缓冲液和1U Taq聚合酶,共进行35个循环,解链温度94℃,1min(首次为3min);退火温度66℃,1min;延伸温度72℃,1min(末次为10min)。

  1.3.4  基因扫描分析  2μl经荧光素Fam标记的PCR产物,分别加入9.0μl甲酰胺,0.5μl Genescan-500-TAMRA分子量标准品,经94℃变性4min后,于6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳,经ABI 3100 DNA测序仪Genscan分析软件分析产物的长度和荧光素强度,通过峰的形态、高度、位置等分析产物的克隆性。

  2  结果

  2.1  AML-M5b患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达和克隆性增殖  与正常人几乎表达全部24个Vβ亚家族不同的是,9例AML-M5b初治患者外周血T细胞平均表达12.9(12.9±5.8;Range:3~19)个Vβ亚家族,全部9例病人均出现克隆性增殖(寡克隆、双克隆和(或)寡克隆增殖趋势),最多1例患者表达的19个Vβ亚家族,有8个Vβ亚家族呈克隆性增殖(分别是寡克隆Vβ24、Vβ7和Vβ5,寡克隆增殖趋势Vβ1、Vβ2、Vβ4和Vβ15,Vβ10为双克隆增殖)。24个Vβ亚家族中,以Vβ13 表达频率最高(9/9),其次为Vβ14(8/9)、Vβ1(7/9)、Vβ2(7/9)、Vβ8(7/9)和Vβ9(7/9),Vβ20在9例患者中全部不表达,Vβ6、12、18各仅有1例表达,出现克隆性增殖最多的亚家族为Vβ23,共有4例,在9例患者中有7个Vβ亚家族未见有克隆性增殖(图1)。

  图1  9例AML-M5b患者外周血T细胞培养前后TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖变化(略)

  A: 培养前各Vβ亚家族表达情况; B: 培养前各Vβ亚家族克隆性增殖情况;A1:培养后各Vβ亚家族表达情况; B1:培养后各Vβ亚家族克隆性增殖情况。

  2.2  原代白血病细胞经短期培养后,出现DC细胞的某些特征。9例患者外周血MNC(1~2×107)经免疫磁珠分选可获得0.5~2.0×106 CD3+细胞,流式检测纯度为85%以上,台盼蓝染色活性>95%,在9例患者T细胞在培养3~5d出现T细胞的增殖,增殖高峰出现在d10~d14,增殖倍数10~50倍。体外杀伤试验证实诱导后T细胞对自体白血病细胞具有特异性识别作用(资料未显示)。
  
  2.3  AML-M5b患者外周血T细胞经诱导活化后TCR Vβ亚家族表达和克隆性增殖  9例AML-M5b患者自体T细胞培养时间均达到4周,培养后TCR Vβ亚家族数量由培养前的平均12.8个(12.8±5.8)增加至培养后的18.22(18.22±4.09,Range:11~23)个,寡克隆增殖的Vβ亚家族由培养前平均3.78±2.91个增至5.89±3.66个,前后比较,两组的p值分别为0.028和0.051。其中TCR Vβ亚家族表达及寡克隆增殖的增加在Vβ10、13、16等亚家族较为明显(图1,图2)。

  图2  1例M5b患者外周血T细胞诱导前后的基因扫描结果(略)

  A组为患者初诊时的外周血T细胞TCRVβ亚家族的分布及克隆性增殖情况,其中Vβ5和Vβ23为寡克隆增殖,Vβ1为双主峰,接近双克隆,其余为多克隆;B组为经过体外诱导后的T细胞TCRVβ亚家族的分布及克隆性增殖特点,经体外诱导活化后,新增Vβ3、Vβ4等13个Vβ亚家族表达,其中Vβ5和Vβ23在诱导后仍维持寡克隆性增殖,Vβ8有诱导前的多克隆转为寡克隆,新增Vβ15、Vβ16及Vβ22为寡克隆增殖趋势。

  3  讨论
   
  正常情况下,体内TCR的取用是无限制性的,TCR或相应T细胞在分子和细胞群体水平有极为丰富的多样性,当然,对于某个特定的个体,可能存在一定的TCR Vβ的偏移现象,这种偏移现象随年龄的增加呈上升趋势,这可能是机体在长期适应环境的过程中,对某些特定的T细胞亚群的优先选择,或者是其受到某些未明抗原的持续刺激,导致了T细胞亚群的限制性表达。疾病状态下,由于体内存在某些特异的相关抗原,刺激TCR Vβ基因发生针对性和选择性重排,故病人外周血T细胞可表现为选择性表达某些TCR Vβ亚家族T细胞,称为优势表达或限制性表达,并可能出现克隆性增殖的T细胞。
   
  在TCR各链中,互补决定区3(CDR3)是T细胞结合抗原的关键部位,也是T细胞受体库多样性的主要来源。利用RT-PCR和基因扫描方法检测TCR Vβ亚家族利用及其CDR3长度和序列,可以分析T细胞TCR Vβ亚家族的分布和T细胞克隆性增殖特征,据此可以区别正常情况下的多克隆性T细胞和由于特异性抗原(如白血病相关抗原)刺激而产生特异性扩增的单克隆或寡克隆性TCR VβT细胞。
   
  研究发现,绝大部分白血病患者存在克隆性增殖和选择性表达的TCR Vβ亚家族T细胞[3,5,9]。患者的这种TCR Vβ亚家族限制性利用和克隆性增殖,可能与白血病细胞的肿瘤相关抗原持续刺激有关,也可能是白血病细胞对患者T细胞的选择性抑制或者是患者受到其它抗原的刺激。已证实在白血病中,同样存在自体白血病相关抗原诱导的白血病特异性CTL反应。
   
  AML-M5b是急性髓细胞性白血病中具有特定临床特征的一类白血病亚型,为AML各型中预后较差的一种类型白血病,该病好发于老年,患者常不能耐受高强度化疗,一般治疗预后较差。本研究利用基因扫描方法分析了9例初治AML-M5b患者的外周血T细胞的TCR Vβ亚家族利用和克隆性增殖情况,与正常人几乎表达全部24个Vβ亚家族不同,9例AML-M5b初治患者外周血T细胞仅表达部分Vβ亚家族,9例患者的Vβ亚家族分布呈现一定的集中趋势,但因病例数不多,尚未见有明显的规律性。
   
  全部9例患者均发现有克隆性增殖(寡克隆、双克隆及寡克隆增殖趋势)T细胞存在,最多1例患者有8个Vβ亚家族呈克隆性增殖。在9例患者中,有4例患者出现Vβ23亚家族的克隆性增殖,此种现象是否同患者优势利用某些Vβ亚家族识别AML-M5b患者的白血病相关抗原有关,值得今后进一步研究(如患者HLA分析、白血病细胞的抗原表达分析以及扩大病例数等)。
   
  由于受白血病细胞的影响,患者的细胞免疫功能明显受抑,体外培养可以脱离白血病细胞对T细胞的影响,本研究采用免疫磁珠分选患者T细胞(纯度可达90%以上),以短期培养的患者白血病DC细胞联合CD3单抗、CD28单抗及IL-2体外诱导活化患者自体T细胞, 9例患者T细胞在体外能够短期培养及显著扩增,对诱导后的患者T细胞进行TCRVβ亚家族及克隆性分析发现,诱导后T细胞同培养前的患者TCRVβ亚家族的取用及出现克隆性增殖的Vβ亚家族不完全相同,短期培养后的T细胞TCR Vβ亚家族表达数量和寡克隆增殖较培养前均有所增加. 在培养过程中,有一些Vβ亚家族始终表现为克隆性增殖状态(如图2),部分多克隆增殖的Vβ亚家族T细胞在诱导后转为寡克隆增殖,提示患者T细胞在白血病抗原的刺激下,对部分Vβ亚家族的优势取用,经体外诱导的T细胞能够特异性识别并杀伤自体白血病细胞(资料未显示),推测这些克隆性增殖的TCRVβ亚家族T细胞可能为患者的自体白血病特异性CTL[8,9]。
   
  对白血病患者外周血T细胞TCRVβ亚家族优势利用及T克隆性增殖的研究,不仅有助于了解白血病患者的细胞免疫状况,而且利于认识白血病细胞的抗原表达及其诱导抗原特异性T细胞的增殖规律。体外成功诱导活化并大规模扩增患者自体白血病特异性CTL,为开展白血病特异性过继性细胞免疫治疗提供了可能。

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作者单位:广州市第一人民医院血液科,广东 广州 510180.


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