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结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

来源:中国热带医学 作者:何树梅,袁莉 2010-1-13
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摘要: 【摘要】 目的 为了解新疆地区结核分支杆菌耐异烟肼(INH)分离株Kat G基因突变情况,探讨其在INH耐药性中的可能作用。 方法 采用PCR和PCR-SSCP方法对60株结核分支杆菌临床分离株Kat G基因突变进行检测。 结果 以结核分支杆菌H37RV为对照,28株药物敏感株的KatG基因PCR扩增产物273bp片段28例SSCP图谱正常。 结......


【摘要】  目的 为了解新疆地区结核分支杆菌耐异烟肼(INH)分离株Kat G基因突变情况,探讨其在INH耐药性中的可能作用。 方法 采用PCR和PCR-SSCP方法对60株结核分支杆菌临床分离株Kat G基因突变进行检测。 结果 以结核分支杆菌H37RV为对照,28株药物敏感株的KatG基因PCR扩增产物273bp片段28例SSCP图谱正常。32例耐INH分离株中KatG基因扩增均阳性,其中11株SSCP图谱异常,其敏感性为34.37%。 结论 新疆地区结核分支杆菌INH耐药株存在KatG基因突变,其突变对INH耐药性的影响有待于进一步研究。

【关键词】  分支杆菌;结核Kat G基因; PCR-SSCP耐药;异烟肼

 Study on the molecular mechanism of isoniazid resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.

  HE Shu-mei, YAUN Li.

  (Department of Pathobiology and Immunology of Shihezi University Medical College, Shihezi 832002, Xinjiang, P. R. China)

  Abstract:Objective  To identify if there is correlation between INH resistance and KatG mutation of Mycobaterium tuberculosis in Xinjiang region and the mechanism of INH tolerance of Mycobaterium tuberculosis in Xinjiang at molecular level.  Methods  There 60 clinical isolates of Mycobacterium tubeculosis (32 isolates was resistant to drugs and 28 sensitive to drugs ) were detected by using PCR and PCR-SSCP.  Results  SSCP pattern of Mycobacterium tubeculosis H37RV was as contral, SSCP patents of KatG gene with the size od 273bp amplified by PCR from 28 sensitive isolates were same as that of control.  There the SSCP pattern of 11 isolates out of 32 isolates expressing KatG gene and reisistant to drugs were abnormal with a mutation rate of 34.37%.  Conclusion  The occurrence of drug resistance of INH isoaltes of Mycobacteriu tuberculosis in Xinjiang might be due to mutation of KatG gene and mechanisms of drug resistance should be further investigated on molecular level.
  
  Key words:Mycobacterium tubeculosis; KatG gene; PCR-SSCP; Drug resistance; Inoniazid

  异烟肼(INH)自抗结核作用被发现以来一直是预防和治疗结核病的最主要的一线抗结核药物之一。随着INH的广泛使用,其耐药率逐年上升,有报道[1]我国INH耐药率已排在首位, 新疆又是全国结核病的高发区,结核病患病率一直位于全国前列[2]。在1979~2000年进行过4次全国结核病流行病学调查[3],新疆的患病率、涂阳率和死亡率的下降幅度较为明显,但各项指标均高于全国同期水平。揭示新疆结核杆菌耐异烟肼的机制,建立一种对临床分离株乃至临床标本进行快速检测耐药的手段,是临床迫切需要解决的问题。目前虽有PCR-SSCP检测耐异烟肼基因的报道,但新疆结核杆菌耐异烟肼katG基因无报道,从而使目前标准的化疗方案治疗失败。为此,本研究应用聚合酶链反应(PCR)和PCR-SSCP方法,对新疆部分地区结核杆菌INH耐药分离株的KatG基因进行分析,了解其缺失或突变情况,以探讨其在INH耐药中的可能作用。现将结果报告如下。

  1  材料与方法

  1.1  H37RV标准株来源于北京结核病研究所;结核分支杆菌分离株来自新疆地区结核病防治研究所及医院。根据“结核病诊断细菌学检验规程”进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌并对异烟肼耐药。选择60株临床分离株包括28株敏感株和32株耐INH或含耐INH的临床分离株进行研究。

  1.2  引物  PCR扩增产物273bp的引物由中国人民解放军309医院所合成,引物序列见文献[4]。

  1.3  方法

  1.3.1  细菌DNA的制备  结核分支杆菌临床分离株DNA用解放军309医院研制的PCR前处理试剂盒提取。

  1.3.2  扩增程序为  94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸30sec,循环30次,最后72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测出现273bp条带即为扩增阳性。对扩增阴性标本取扩增产物1ul其他条件不变进行二次扩增。

  1.3.3  SSCP银染分析  PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测,扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10min,立即冰浴5min,然后上样于经30min预电泳的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,硝酸银染色后观察结果并照相。

  2  结果

  2.1  PCR扩增结果  以结核分支杆菌标准株(H37RV)DNA为对照,用上述引物扩增60株临床分离株,其中28株INH耐药株,32株INH敏感株,经2%琼脂糖电泳,均扩增出一条片段长度为273bp的产物。见图1。

  图1  PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱(略)

  Figure 1  The results of agarose gel electrophoresis of PCR products
 
  Lane1: H37RV (273bp); Lane 2-5:positive results (273bp);Lane 6:negative control(DH2O);Lane 7:DNA marker

  2.2  60株结核分支杆菌PCR-SSCP分析  28株INH敏感株的SSCP图谱均与H37RV相同,32株INH耐药菌中,7株高度INH耐药株和4株低度INH耐药菌的SSCP图谱有差异,其余INH耐药菌的SSCP图谱与H37RV相同见图2。因此以比例法药敏实验结果为对照,SSCP检测结核杆菌临床分离株INH耐药性的敏感度为34.37%,特异性为100%。两组经统计学处理差异有非常显著性(χ2=11.79,P<0.01),见表1。图2中可见,经解链后,INH敏感株与参考株H37RV的单链DNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率相同,而耐药株则与标准株的迁移率有差异,提示耐药株可能有碱基突变。

  图2  SSCP银染结果(略)

  Figure 2  Silver stain results of SSCP

  Lane 1: H37RV ; Lane 2,4,6: INH resistant isolates; Lane 3,5 : INH susceptible isolates

  表1  结核分支杆菌KatG扩增及SSCP结果(略)

  3  讨论

  结核分支杆菌耐INH与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因KatG和/或烯酰基还原酶编码基因inhA突变有关。KatG基因的突变导致过氧化氢酶-过氧化物酶活性降低或丧失,阻止INH转换成活性形式,导致耐药。KatG 基因位于结核分支杆菌染色体上,含2223个核苷酸,结核菌耐INH的机制比较复杂,katG基因的突变、部分缺失是主要机制,约10%~24%分离株发生KatG完全缺失,过氧化氢酶-过氧化物酶阴性,高度耐INH,50%~70%出现点突变部份缺失或插入。该基因的完全缺失在INH耐药株中只占很小一部分但导致高度耐药[5]。多数文献都对KatG基因中315位AGC突变成ACC及463位CGG突变成CTG作了报导,认为这两个突变和耐药性关系最密切[6,7]。近年来有些学者认为KatG基因中R463/L突变无意义[6]。inhA,ahpC,ndh等基因和结核菌对INH的耐药关系正在研究之中,最近又提出kasA可能是一个耐药相关基因[8]。1992年,Zhang等[9]首次从基因水平上对M.T INH耐药性进行研究,发现在3株 MIC>50μg/ml的高浓度耐药株中,有2株完全缺失KatG基因,认为M.T中KatG基因的完全缺失导致了过氧化物酶不被表达,从而引起M.T耐药性。Altamirano 等[10]对9株INH耐药株进行了PCR-SSCP及测序分析,9株中仅1株(11%)有KatG基因的缺失,8株存在点突变和1-3个碱基的插入。国内学者张宗德等报道[11]KatG基因突变率为 57%。据WengenackNL等[12]报道,KatG基因突变是耐INH分离株常见的一种突变,发生率约68%,并证实KatG基因突变位置不同,其表达产物过氧化氢酶和过氧化物酶活性亦有不同。Morris等[13]用PCR-SSCP方法在42株INH耐药株中,检测到24株(57%)KatG基因的突变,但是没有发现KatG基因的缺失。国内吴雪琼等[14]报道通过PCR-SSCP检测KatG基因突变,突变率为64%。本研究采用PCR-SSCP技术对新疆地区32株耐INH的结核分支杆菌临床分离株及28株敏感株KatG基因突变研究的结果表明,耐INH临床分离株KatG突变率为34.37%,没有发现KatG基因完全缺失,敏感株未发现突变,特异性为100%。这与国内外的报道[15,16]相似,两者数值基本一致,表明KatG基因突变是结核分支杆菌耐异烟肼临床分离株主要的基因突变类型。提示MTB(Mycobacterium tuberculosis,结核分支杆菌)耐INH药物的发生率无国家和地区差异。可能是MTB基因组相当稳定,进化变异缓慢所致。由于本文耐INH株中没有发现KatG基因完全缺失,这与文献报道的10%~20%的结核分支杆菌耐INH分离株KatG基因完全缺失不一致,但并不表明KatG基因完全缺失不可能是新疆地区结核分支杆菌耐INH产生的一种分子机制,需加大样本量进一步验证。对katG基因进行DNA测序,发现10株异烟肼耐药株katG基因3I5位密码子发生突变,突变株所占的比例为10/11。其中8株为常见的突变类型(AGC-ACC),另两株为国外报道过的突变类型(AGC-AAC),315位氨基酸由Ser突变为Asn,此突变已证实与高耐药量有关,此突变株所占有的比例为2/11,这提示此突变类型可能具有地区分布特点,需要通过加大样本检测量加以进一步验证。没有发现文献报道的AGC-ACA类型的稀有突变[17],这一方面可能是由于样本量有限造成的,本研究仅有60份样本,来源局限,分布不均,数据难免出现偏差。另一方面可能提示,此类型突变在各个地区分布不同。在检测异烟肼耐药性问题时,为了防止漏检,有必要对这种突变进行检测。有报道[18]inhA基因、ahpc基因也与INH耐药有相关性,INH耐药机理尚有待进一步研究。而本研究中有katG基因突变的只占34.37%。这可能和结核菌耐异烟肼机制复杂,而本研究只对katG基因的含315位密码子的273的片段进行测序因而不能检出katG基因的其它片段及与异烟肼耐药相关的其它基因的变异情况有关。也可能和标本量小有关系。
   
  当然,我们所调查的结核杆菌菌株量不多,还不能完全说明本地区结核杆菌耐药发生的突变位点,有必要进行深入研究以揭示其耐药机制。

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作者单位:新疆兵团科委资助课题(NO 04GG23) 石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室,新疆 石河子 832002.


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