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结核分枝杆菌蛋白芯片检测对结核病诊断的价值

来源:中国热带医学 作者:吴艳,赵英,符生苗,蔡俊宏 2010-1-13

摘要: 【摘要】 目的 探讨结核分枝杆菌IgG抗体的检测及其临床应用价值。 方法 应用蛋白芯片识别仪分析结核病人血清中结核菌蛋白16Kda和38Kda以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)抗体含量,同时与ELISA法进行比较,判断其敏感性、特异性和总符合率。 结果 结核蛋白芯片检测的敏感性和特异性分别为68。11%,而ELISA法检测的敏感......


【摘要】    目的 探讨结核分枝杆菌IgG抗体的检测及其临床应用价值。 方法 应用蛋白芯片识别仪分析结核病人血清中结核菌蛋白16Kda和38Kda以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)抗体含量,同时与ELISA法进行比较,判断其敏感性、特异性和总符合率。 结果 结核蛋白芯片检测的敏感性和特异性分别为68.96%、81.11%,而ELISA法检测的敏感性和特异性分别为61.81%、85.56%。两者检测的总符率为73.90%,两种方法的敏感性差异具有显著性(χ2=4.1,P<0.05)。 结论 结核蛋白芯片检测对肺结核及肺外结核病人具有较好的诊断价值,可作为结核病的血清学辅助诊断之一。

【关键词】  结核分枝杆菌 结核蛋白芯片 ELISA法

  The value of detection of Mycobacterium tuberculosis with protein chip in diagnosis of tuberculosis.

  WU Yan, ZHAO Ying, FU Sheng-miao, et al.

  (Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan, P. R.China)
   
  Abstract:Objective  To discuss the assay methods and clinical value of IgG antibody to Mycobacterium Tuberculosis.  Methods  To detect the antibody levels of tuberculoprotein 16KDa, 38KDa and LAM by Protein Chip and ELISA together, the sensitivity, specificity and total coincidence rate of the two methods were compared.  Results  The sensitivity and specificity of Protein Chip were 68.96%, 81.11% respectively, and these of ELISA were 61.81%, 85.56%, the total coincidence rate of the two methods was 73.90%. There was significant difference between the sensitivity of the two methods(χ2=4.1, P<0.05).  Conclusion  The Tuberculosis Protein Chip Assay has preferable value in diagnosis pulmonary and non-pulmonary tuberculosis patients.
   
  Key words:Mycobacterium Tuberculosis; Protein Chip; ELISA

  目前,全球人口中大约1/3的人口已感染结核分枝杆菌,15岁以下儿童感染者达1.8亿,有2000万活动性结核病患者,每年新发病例800万人,死于结核病的人数约300万。我国的结核病疫情相当严峻,现有结核病人约450万,每年病死近20万人[1]。因此,实现早期诊断结核分枝杆菌感染及建立准确、快速简便的试验试验方法,已成为结核病研究的重点。目前已有的结核抗体检测试剂均为未纯化的结核菌液抗原,存在特异性差的缺陷[2]。我们应用南京大渊生物枝术工程公司生产的基因工程表达的结核菌蛋白16Kda和38Kda以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)生产的结核分枝杆菌IgG抗体检测(蛋白芯片)系统进行了检测,取得了满意结果,现报告如下。

  1  材料与方法

  1.1  病例资料  收集从2005年10月~2006年12间诊治的各类患者中,确诊结核病例364例,进行实验对比研究。在364例结核病例中,活动性肺结核210例,慢性肺结核126例,结核性胸膜炎、淋巴结核、骨结核、肾结核病人28例;健康对照组90例来自门诊体检的健康人群。

  1.2  标本采集  真空采集静脉血分离血清,新鲜血样在2~8℃环境下存放不要超过48h,长期保存的标本应在-20℃以下冻存,避免反复冻融。

  1.3  试剂与仪器  结核分枝杆菌蛋白芯片检测系统及PBT-X2蛋白芯片阅读仪由南京大渊生物技术工程有限公司提供。ELISA法结核杆菌抗体检测试剂由四川省绵阳市解放军404医院科技开发部提供。

  1.4  方法  结核分枝杆菌蛋白16Kda和38Kda以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)检测按试剂盒说明书进行,结果根据仪器厂家设置参数自动判别。采用SAS(6.12)进行卡方检验和相关分析。

  2  结果

  2.1  结核蛋白芯片检测不同型别结核病人的阳性率  活动型肺结核、慢性肺结核、肺外结核病人的敏感性分别为74.29%(156/210)、63.49%(80/126)、53.57%(15/28)。结核病人总的敏感性为68.96%(251/364)。90例正常对照的假阳性率为18.89%(17/90)。阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为93.66%(251/268)、39.04%(73/187)和150.07%,见表1。

  表1  不同类型结核病人结核蛋白芯片阳性检出率(略)

  2.2  各组结核蛋白芯片检测指标的意义  结核病人的3种抗体阳性率以抗LAM的阳性率最高,占56.04%(204/364),次之是抗38KDa抗体50.55%(184/364),最低为抗16KDa抗体26.10%(95/364)。结核菌蛋白LAM和38KDa抗体二种均阳性为32.69%,结核菌蛋白三种抗体均阳性为12.36%。单个抗体阳性检出率分别为:LAM 抗体7.42% ,16KDa抗体6.87%,38KDa抗体3.30%,见表2。

  表2  结核菌蛋白LAM、16KDa和38KDa抗体的阳性检出率(略)

  2.3  结核蛋白芯片和ELISA检测结果的比较  ELISA法检测结核病人标本的阳性率为61.81%(225/364),对照组阳性率为14.44%(13/90),特异性为85.56%(77/90)。结核蛋白芯片法检测结核病人抗体的总阳性率为68.96%(251/364),特异性为81.11%,对照组阳性率为18.89%(17/90),见表3。两种方法比较敏感性差异有显著性(χ2=4.1,P<0.05),特异差异无显著性(χ2=0.64,P>0.05),见表3。

  表3  结核抗体蛋白芯片和ELISA检测结果比较(略)

  2.4  结核蛋白芯片与ELISA法检测的符合率  两种方法同时检测结核病人血清标本3种抗体均阳性225例,均阴性44例,合计为269例,符合率为73.90%(269/364)。

  3  讨论
   
  结核病的诊断,尤其是在早期因为临床症状不典型,如肺外结核(包括结核性胸膜炎、骨关节结核等)常难予做出明确诊断,给临床造成一些结核病的漏诊和误诊。蛋白芯片是近年来蛋白组学研究中兴起的一种新方向[3]。结核蛋白芯片的的基本原理是以微孔滤膜为载体,同时将结核菌的特异性细胞壁脂多糖抗原LAM和经基因工程重组DNA技术生产纯化的结核菌16KDa和38KDa特异性抗原固定在特制载体上,利用微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用,捕捉被检样品中特异性抗体,使抗原抗体反应在固相膜上快速进行,复合物再与胶体金标记的免抗人IgG作用,在膜上形成紫红色斑点。然后通过芯片识别系统进行结果分析。分别测定出抗结核菌的特异性细胞壁脂多糖LAM的抗体、 16KDa抗体和38KDa抗体。实现了这三种抗体进行同步检测,从而对结核菌感染做出诊断。
   
  LAM是一种结核杆菌细胞壁的脂多糖成分,具有较强的抗原性,其检测的灵敏感性较高,是其他分枝杆菌所不具有的或者其含量远低于结核菌,约有75%的人群感染结核菌后会产生针对LAM的特异性抗体。38KD抗原是引起人结核病的结核分枝杆菌含有一种特异性蛋白质抗原。即使已经预防接种,也不会影响检测结果。并且患者体内针对 38KD的抗体与患者的感染程度有良好的线性关系,可以动态监测该抗体,用于结核病的治疗考核及抗药物的选择。16KDa蛋白仅发现于结核菌复合物中,在其他分枝杆菌不存在该抗原的基因,因而也不表达该抗原。而其他分枝杆菌感染不能诱导机体产生抗16KDa蛋白抗体,且该抗原阳性对儿童结核病和肺外结核的诊断提供较好的信息[4,5]。因此,从结核病患者血清中可以检测到结核菌蛋白LAM、16KDa和38KDa特异性抗体,对结核病患者做出早期诊断。
   
  本研究结果表明结核蛋白芯片法比ELISA检测法敏感性高,特异性无明显差异,结核分枝杆菌IgG抗体的敏感性为68.96%,特异性为81.11%,阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为93.66%、39.04%,结核蛋白芯片检测与ELISA法检测的符合率为73.90%。但ELISA法所需时间较长,易受多种因素的影响;结核蛋白芯片检测时间短,且结核蛋白芯片实现了三种抗体同时联合检测,对结核菌感染的血清学辅助诊断具有很高的敏感性、特异性及方法简便、快速的特点,能对结核病患者做出早期诊断以及鉴别诊断,在流行病学调查等方面具有广泛应用价值。

【参考文献】
    [1] 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中华结核和呼吸杂志,2002,25:3~5.

  [2] 鲁起超,董云秋.血清分枝杆菌抗体对结核病的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志,1998,21:82.

  [3] Mouradn S.Lab-on-a-chip:appjications in proteom ics[J].Curr Opin Chem Bi,J,2002,61:51~56.

  [4] 张小刚,庄玉辉,何秀云,等.重组结核分枝杆菌38KDa和16Kda蛋白用于结核病血清学诊断的价值[J].中国防痨杂志,2001,23:281~283.

  [5] 孔忠顺,管波清,古淑香,等.血清脂阿拉伯甘露糖及38KDa抗体检测对涂阴性结核及肺外结核诊断价值[J].中国防痨杂志2002,24:140~142.


作者单位:海南省人民医院,海南 海口 570311.


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