蛋白免疫印迹和荧光-PCR诊断早期先天梅毒研究

    摘要:目的 评价荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和血清IgM抗体蛋白免疫印迹实验（serum IgM western blot，IgM-WB）在新生儿先天梅毒早期诊断中的作用。 方法 在知情同意的情况下，选取34例梅毒孕妇及其新生儿和40例非梅毒对照孕妇及其新生儿，分别给予荧光定量聚合酶链反应、血清IgM-WB试验和常规血清学方法（TPPA、RPR、19S-FTA-ABS），以双盲对照的形式评价上述实验诊断方法和常规实验室检测（临床+常规血清学方法RPR滴度的比较+治疗）在先天梅毒早期诊断的作用。 结果 34例孕妇梅毒病例所生的新生儿中，按常规综合诊断方法3例确诊为先天梅毒，6例拟诊为先天梅毒。34例完成妊娠的梅毒孕产妇病例中，孕妇胎盘和脐带组织荧光定量聚合酶链反应11例阳性（9例常规方法诊断为先天梅毒）;新生儿血清IgM蛋白印迹试验10例阳性（9例常规方法诊断为先天梅毒）;40例作为对照的非梅毒孕妇及新生儿各项检查均为阴性。 结论 胎盘组织荧光定量聚合酶链反应和血清IgM蛋白印迹试验诊断梅毒，结果显示可能高于现行的常规综合诊断方法的诊断价值，且优于常规综合诊断方法中的任何。
   
　　关键词:先天梅毒;梅毒螺旋体;诊断;胎盘组织荧光定量聚合酶链反应;血清IgM蛋白印迹试验
   
　　The value of FQ-PCR and Western blot in early diagnosis of congenital syphilis.

　　ZHANG Rong，ZHOU Hua，PAN Peng，et al.

　　（Baoan District Chronic Disease Hospital of Shenzhen City，Shenzhen518133，Guangdong，P.R.China）
   
　　Abstract:Objective To evaluate the effects of FQ-PCR and Western blotting（WB）in detection of placental Treponema pallidumDNA for diagnosis of congenital syphilis. Methods Thirty-four placental specimens from pregnant women with syphilis and forty specimens from health pregnant women were evaluated by using double blind methods:（1）FQ-PCR and WB for placental Treponema pallidumDNA;（2）Traditional comprehensive approach for the diagnosis of congenital syphilis.The results were com-pared. Results Positive FQ-PCR（9congenital syphilis）was observed in11out of the34placental specimens from syphilitic women，10positive serum IgMwas detected by Western blot（9congenital syphilis）.No positive results were observed in the40in-fants from health mothers. Conclusion The diagnostic value of FQ-PCR and Western blot in detection of placental Treponema pallidumDNA and serum IgM is superior to any one of the conventional methods.

　　Key words:Congenital syphilis;Diagnosis;FQ-PCR;Western blot
      
　　近年来，梅毒在我国的再次流行，先天梅毒的发生率也迅速增加，因此，加强孕妇梅毒和先天梅毒的防治具有极重要的作用。然而在先天梅毒的诊断中，对有典型表现的先天梅毒容易诊断，但先天潜伏梅毒病例的早期诊断较为困难。我国先天梅毒的诊断均依据“中华人民共和国国家标准梅毒诊断标准及处理原则”和美国疾病控制中心1988年提出的先天梅毒的修订诊断标准。两诊断标准均以临床和血清学（主要IgG法）结合的方法为主，无论是敏感性和特异性均存在明显不足。因此，开发先天梅毒的早期、敏感和特异的实验室诊断方法就十分必要。现选用荧光PCR法和免疫蛋白印迹实验对梅毒孕妇的新生儿进行检测，以探讨先天梅毒的诊断方法，为先天梅毒的早期诊断提供依据。

　　1 材料和方法
   
　　1.1 对象和材料 选取2001年7月～2004年3月，在深圳市各医院产科就诊的孕妇中，参照“中华人民共和国国家标准梅毒诊断标准及处理原则”对梅毒血清学试验阳性者，这些孕妇均自愿参加本研究，并获得知情同意。排除中途失访及未获取完整标本者，共有47名梅毒孕妇完成了整个研究过程。确诊时早期妊娠5例（其中一期梅毒1例，潜伏梅毒4例）:中期妊娠19例（其中一期梅毒2例，二期梅毒2例，潜伏梅毒15例）:晚期妊娠23例（其中二期梅毒2例，潜伏梅毒21例）。共计一期梅毒3例，二期梅毒4例，早期潜伏梅毒2例，晚期潜伏梅毒（包括病期不明）38例。47名梅毒孕妇中，34名完成产程，13名中止妊娠（均为人工引产）。38例孕妇接受了正规的驱梅治疗，其中29例完成妊娠。按照美国疾病控制中心提供的性传播疾病治疗指南，于妊娠早期和晚期给予青霉素（苄星青霉素或普鲁卡因青霉素）治疗。9例孕妇未治疗或治疗不充分（已行治疗，但疗程不足或未按照标准治疗均为治疗不充分），其中5例完成妊娠。共34名孕妇及新生儿获取了完整的标本。随机选取40名到深圳市各医院产科就诊的梅毒血清学试验阴性孕妇完成妊娠者为对照。
   
　　所有新生儿中，仅3例有与先天梅毒的一致的临床表现，其中1例有皮肤表现，全身皮肤出现皱折，四肢躯干暗红色斑疹，掌趾轻度脱皮;1例表现为肛周扁平湿疣，1例出现掌趾脱皮，并伴发心、脑、肝、肾多脏器衰竭。全部对象均由专人在严格无菌操作的情况下，取生产和引产的新鲜胎盘胎膜、全层胎实质和脐带标本以及生产后马上取母亲和新生儿肘静脉血。取下的完整胎盘和脐带标本各一份分别放入经严格清洗、灭菌的带盖塑料瓶中，-20℃低温保存（保存时间小于3个月），血液标本置-20℃冰箱低温保存。
   
　　1.2 试剂和仪器 BIO-RADiCycler荧光PCR检测仪;UNIQ-10柱式临床样本基因组抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）;TP-FQ-PCR试剂盒（深圳匹基生物制品公司）;RPR试剂（上海荣盛生物技术有限公司）;TPPA试剂（日本富士瑞必欧株式会社）;FTA-ABS-19S-IgM试剂盒和TP抗体蛋白印迹TP-IgM-WB试剂盒（德国欧蒙医学实验室诊断试剂有限公司）。
   
　　1.3 方法 TP-FQ-PCR法、TPPA法和血清IgM-WB试验操作方法参照说明书。

　　2 结果
   
　　2.1 47例梅毒孕妇及其所生的34例新生儿梅毒的检测 13例人工引产后获得的胎盘和脐带中6例FQ-PCR阳性，阳性率为46.15%。34例完成妊娠的胎盘和脐带中，11例FQ-PCR为阳性，阳性率为32.35%。总共47例样本中17例阳性，阳性率为36.17%;40例非梅毒孕妇的胎盘和脐带样本均为阴性;34例新生儿中，10例（29.41%）血清TP-IgM-WB实验阳性。根据美国疾病控制中心提出的先天梅毒的修订诊断标准 ［1］ ，9例诊断为先天梅毒（包括确诊1例和拟诊8例）中，有1例为实验室检查证实TP;有3例为母亲梅毒非螺旋体及螺旋体血清学试验阳性，新生儿出现早期先天梅毒的典型临床表现;有3例为母亲和新生儿非螺旋体及螺旋体血清学试验阳性，分娩时新生儿非螺旋体血清学试验滴度大于或等于母亲滴度的4倍;有3例为分娩时新生儿和母亲的非螺旋体与螺旋体血清学试验均为阳性，新生儿FTA-ABS-19S-IgM阳性;有1例为母亲非螺旋体及螺旋体血清学试验阳性，新生儿FTA-ABS-19S-IgM阳性;有5例为妊娠期间梅毒未治疗或治疗不充分的妇女所生新生儿。
   
　　2.2 FQ-PCR与常规综合诊断比较 结果两方法诊断梅毒差异无显著性（P>0.05），显示两种方法间有较好的一致性（Kappa值>0.6），见表1。
   
　　表1 34例新生儿梅毒FQ-PCR与常规检查结果比较（略）
   
　　2.3 胎盘和脐带组织FQ-PCR及TP-IgM-WB测试分析 结果两方法诊断梅毒差异无显著性（P>0.05），显示两种方法间有较好的一致性（Kappa值>0.6），见表2。
   
　　表2 胎盘脐带FQ-PCR试验与TP-IgM-WB检查结果比较（略）
   
　　3 讨论
   
　　先天梅毒（Congenital syphilis，CS）又称胎传梅毒，是指梅毒螺旋体由母体经过胎盘进入胎儿血循环而使胎儿受染而发生的新生儿、婴儿、和儿童的梅毒。危害性大，给社会带来极大的负担。对先天梅毒儿进行早期诊断、及时干预十分重要。利用敏感特异的实验室诊断方法又是其中的关键。随着各种新技术和新方法的出现，一批极有前途的实验室方法已被运用到先天梅毒的诊断中。免疫蛋白印迹试验是80年代发展起来的一种先进的检测技术，结合分子生物学和免疫学特点，敏感性高，特异性强，使用蛋白印迹试验检测梅毒螺旋体感染胎儿/新生儿产生的特异性的IgM和IgA抗体。据国外学者报道，免疫印迹在诊断有体征先天梅毒儿的敏感性是83%～92%，对无体征者的敏感性为42%～83%，而对长骨X线征正常者则敏感性为75%.特异性为90%。与之相比较，FTA-ABS-19S-IgM敏感性仅为73%，但WB对脑脊液的敏感性仅为47% ［2～5］ 。
   
　　FQ-PCR技术则是在PCR技术的基础上开发出来的新技术，它利用了基因扩增的敏感性，分子杂交的特异性和光化学的精确性，把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。与竞争性PCR、PCR-EILA等定量PCR相比 ［6］ ，FQ-PCR除了快速、操作简便，不需对PCR产物进行后处理，防止扩增产物污染等优点外，还具有定量范围宽、定量准确等优点。Grim-prel ［7］ 和Sanchez等 ［8］ 的研究结果表明，PCR对先天梅毒诊断的敏感性为74%，特异性为96%。目前国内外运用这两种技术来诊断先天梅毒，对两者的系统比较和评价报道甚少。
   
　　本研究中，34例胎盘和脐带组织标本中11例FQ-PCR阳性，显示胎盘和脐带组织作为FQ-PCR的样本是完全可行的，且具有较高的检出率。Konrad等和Jennifer等认为损伤部位的分泌物、血清、脑脊液、羊水和组织为样本均可用于PCR检测TP的结论一致 ［2，3］ 。而10例WB阳性也证实了WB检测诊断先天梅毒的价值。常规诊断9例先天梅毒，该9例的相应的FQ-PCR和WB结果均为阳性，统计分析显示尚不能认为TP-IgM-WB和FQ-PCR的结果与常规综合诊断的结果差异有显著性。三种方法间有较好的一致性（Kappa值>0.9）。而TP-IgM-WB和FQ-PCR两种方法本身也具有较好的一致性（Kappa值>0.6）。因此认为FQ-PCR和TP-IgM-WB技术具有不低于常规综合诊断方法的敏感性。
   
　　与常规综合诊断方法（临床症状，母/婴RPR滴度之比和FTA-ABS-19S-IgM试验）中检出率最高的FTA-ABS-19S-IgM试验比较，6例FTA-ABS-19S-IgM试验阳性病例，FQ-PCR和TP-IgM-WB均为阳性。而2例有先天梅毒典型症状的病例，FTA-ABS-19S-IgM试验为阴性，FQ-PCR和TP-IgM-WB均为阳性，提示FQ-PCR和TP-IgM-WB检查敏感性高于FTA-ABS-19S-IgM试验。以上分析说明，FQ-PCR试验用于先天梅毒诊断优于三种常规综合诊断方法中的任何一种。40例非梅毒孕妇胎盘和脐带组织的FQ-PCR和TP-IgM-WB检查结果均为阴性，显示FQ-PCR和TP-IgM-WB技术有较好的特异性。
   
　　在13例人工引产后获得的胎盘和脐带组织中FQ-PCR检测出6例阳性，检出率为46.15%，较完成妊娠的胎盘和脐带组织标本的检出率高，可能与引产前孕妇未治疗或治疗时间相对较短有关。虽然，引产胎儿未进行尸检而未能确诊是否患有先天梅毒，但也可以作为今后引产和死产胎儿先天梅毒的诊断的参考，而且其中4例孕妇产前未行青霉素治疗的标本均可拟诊为先天梅毒，其FQ-PCR检查结果均为阳性，也证实了FQ-PCR技术具较高的敏感性。
   
　　但是实验中10例TP-IgM-WB阳性，而FQ-PCR则为11例阳性（包括10例TP-IgM-WB阳性患儿）。但确诊仅9例（根据现在的诊断方法）。对这2例患儿进行治疗，追踪。提示可能是TP-IgM-WB阳性和FQ-PCR存在假阳性或是现在的诊断方法存在遗漏。因为病例的局限，样本量仍偏小，因此，还需要进行大规模的试验研究，以进一步证实FQ-PCR技术检测胎盘和脐带组织中TP DNA和TP-IgM-WB这两方法在先天梅毒诊断中的价值。

　　参考文献:
    
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　　［7］Grimprel E，Sanchez PJ，Wendel GD，et al.Use of polymerase chain reac-tion and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid，fetal and neonatal sera，and cerebrospinal fluid［J］.J Clin Microbi-ol，1991，29:1711～1718.
   
　　［8］ Sanchez PJ，Wendel GD，Grimprel E，et al.Evaluation of molecular methodologies and rabbits infectivity testing for the diagnosis of congenital syphilis and central nervous system invasion by Treponema pallidum［J］.J Infect Dis，1993，167:148～157.