ACE与AT1R基因多态性及其相互作用对心衰预后的影响

　　The impact of genetic polymorphisms of angiotensin-converting enzyme and angiotensin II type I recep-tor and their correlation on the prognosis of heart failure.ZHENG Yin，FANG Zhuang-wei，Barry Lon-don，et al.（Department of Cardiovascular Center of Hainan Provincial People's Hospital，Haikou570311，　Hainan，P.R.China）      　　

　　Barry London　Dennis M.McNamara

　　本文旨在探讨血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）基因插入/缺失（I/D）多态性与血管紧张素II1型受体（angiotensin II type1receptor，AT1R）基因多态性及其相互作用对未行心脏移植心衰预后的影响.

　　1 对象与方法   

　　1.1 研究对象 432名患者来源于美国匹兹堡大学医疗中心的心血管事件基因危险性评价研究组。入选时间为1996年4月～2001年1月。平均年龄（55.8±12.0）岁，男性占72.5%，女性占27.5%，92.1%为白种人，50.2%有心肌缺血。心肌缺血被定义为有心肌梗塞和心脏搭桥术病史，或冠状动脉照影示冠状动脉狭窄>50%。所有患者均为左室收缩功能障碍性心衰（左室射血分数，Left vetricular ejection fraction，LVEF<0.45），平均LVEF为0.24±0.08。

　　1.2 研究方法   

　　1.2.1 收集所有患者临床资料，包括年龄、性别、民族、病因、纽约心功能分级、既往心血管评价及治疗情况。前瞻性随访患者（26.43±18.19）月，随访终点是死亡和心脏移植。   

　　1.2.2 用Pure Gene Kit，Gentra Systems，Inc从患者外周血提取基因组DNA。   

　　1.2.3 ACE基因型测定:用聚合酶链式反应（Poly-merase chain reaction，PCR）检测ACE第16内含子插入/缺失（I/D）等位基因多态性，以其中一长为287bp Alu片段的有无为标志，插入（I）和缺失（D）两种等位基因，组成DD、ID和II3种基因型。引物序列为:5'GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT3'和5'GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC3'。反应条件为:变性94℃30s，退火56℃45s，延伸72℃2min，共扩增35循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外摄影观测结果，可见PCR产物含有597bp基因片段为插入型基因（II），含有319bp基因片段为缺失型（DD），同时含597bp和319bp基因片段为ID型杂合子。因PCR优先扩增D等位基因，对I等位基因扩增不足，一些ID型杂合子可能被误认为DD纯合子，因此设计另一对特异扩增I等位基因的引物序列:5'TGGGACCACAGCGCCCACTAC3'和5'TCGCCAGCC-CTCCCATGCCCATAA3'，再次扩增DD基因型PCR产物，除退火温度改为67℃外，所有反应体系和条件与上述相同。扩增产物有335bp片段的则含有I等位基因，为ID型杂合子，不含335bp片段的则为真DD型纯合子。   

　　1.2.4 AT1R基因型测定 引物序列:5'GCTTTGTCTTGTTGCAAAAGG3'和5'CCCACTCAAAC-CTTTCAACA3'。PCR反应终体系20μl，反应条件为:变性94℃1min，退火56℃1min，延伸72℃1min，共扩增35个循环。扩增产物为249bp片段，用Ddel限制性内切酶（New England Biolab）行酶切反应，37℃消化12h，酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线摄影观测结果，若在此片段有A 1166 →C位点突变，则产生3种基因类型:AA型纯合子（无酶切位点）有249bp片段，CC型纯合子（有酶切位点）有143、106bp片段，AC型为含有249、143、106bp3个片段并存的杂合子。   

　　1.3 统计学分析 所有数据均输入SPSS软件包行统计学分析，分别采用χ 2 检验、方差分析和Kaplan-Meier方法，P<0.05视为有统计学意义。

　　2 结果   

　　2.1 ACE I/D基因型与AT1R基因型分布及临床指标比较 ACE I/D基因型分布频率:纯合子DD基因型31.0%，纯合子II基因型18.7%，杂合子ID基因型50.3%。3种基因型临床各项指标的比较无显著性差异（P>0.05）。AT1R基因型分布频率:纯合子CC基因型8.6%，纯合子AA基因型50.0%，杂合子AC基因型41.4%。I～II级心功能中携带AT1R C等位基因者明显增多（P=0.035），其余各项指标的比较无显著性差异（P>0.05）。   

　　2.2 ACE I/D与AT1R基因型与心衰预后的关系 Kaplan-Meier曲线显示所有患者生存率随着时间的延长而降低，ACE D等位基因的生存率比I等位基因明显降低（1年生存率II/ID/DD=89/80/74，2年=77/69/62，3年=67/58/56，P=0.027），而AT1R3组基因型的生存率无显著性差异（1年生存率AA/AC/CC=79/79/86，2年=67/70/71，3年=58/59/61，P=0.36）。   

　　2.3 ACE I/D与AT1R A1166C基因型的相互作用对心衰生存率的影响 将AT1R1166A/C分为含有A等位基因组（AA，n=216，50.0%）与含有C等位基因组（AC和CC，n=216，50%），在AA型纯合子组ACE II/ID/DD基因型的生存率无显著性差异（1年生存率II/ID/DD=87/81/71，2年=75/68/59，3年=65/56/55，P=0.08）。在AC和CC型组ACE II/ID/DD基因型的生存率也无显著性差异（1年生存率II/ID/DD=87/78/78，2年=75/70/68，3年=65/56/58，P=0.06）。

　　3 讨论   

　　肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin sys-tem，RAS）在心力衰竭的发生和发展过程发挥重要作用。ACE是RAS中的关键酶，催化血管紧张素I转化为血管紧张素II（Angiotensin II，AngII），AngII的数生理学功能主要通过AT1R介导。AngII水平的升高，能使血管收缩，促儿茶酚胺的释放和醛固酮分泌，导致心肌凋亡、心肌肥厚，致间质纤维化及心肌重构，从而影响心力衰竭患者的预后 ［1］ 。   

　　文献显示，ACE I/D基因多态性与血清中ACE水平明显相关，DD型水平最高，II型最低 ［2］ ，DD型是心肌梗塞、扩张型心肌病及心力衰竭的危险因素。本研究结果显示，在左室收缩功能障碍性心衰患者的3年随访中，ACE DD基因型的生存率较ID和II型明显降低，与文献报道符合 ［3］ ，提示ACE DD基因型可作为心力衰竭患者预后的预测因素。   

　　血管紧张素II受体主要分为血管紧张素II1型受体（AT1R）和血管紧张素II2型受体（AT2R）两型，AT1R介导Ang II的大多数生物学作用。Bonnardeaux分析AT1R基因的编码区及非编码区，发现有5个多态性位点，其中只有位于3'末端非编码区1166位点上腺嘌呤（Adenine，A）突变为胞嘧啶（Cytosine，C）的变异与心血管疾病有关 ［4］ 。研究表明，AT1R C等位基 因与高血压、冠状动脉硬化、心肌肥厚和心衰的发生相关，而与心衰预后无关。本研究结果显示，AT1R1166A/C3种基因型3年生存率无显著性差异，提示AT1R C等位基因并不影响心衰的预后，与Andersson B等报道相符 ［5］ 。其可能的机制是AT1R A1166C突变位于3'端非翻译区，其基因本身编码区无致病性突变功能，故不能调控心衰的进展。   

　　ACE I/D和AT1R1166A/C两种基因多态性的协同作用可增强RAS活性，有研究证实，ACE基因DD型与AT1R C等位基因的协同作用可增加心脏缺血性事件发病的风险性，但这两种基因多态性的协同作用是否影响心力衰竭的预后仍不清楚。迄今为止，仅有Andersson B ［5］ 的研究报道ACE基因DD型并携带AT1R C等位基因的心力衰竭患者的7年生存率明显降低，提示ACE和AT1R A1166C基因多态性可能存在协同作用，对心衰的预后产生影响。但我们的研究结果显示，在对432名收缩功能障碍性心力衰竭患者中，无论是AA型纯合子组还是含C等位基因组，ACE II/ID/DD3组基因型的3年生存率均无显著性差异。说明在影响心衰预后方面，ACE I/D和AT1R1166A/C基因之间未见有协同作用，与Andersson B的报道不符。其可能的原因是，我们研究组中携带AT1R C等位基因的患者心功能较好，而Andersson B研究组中携带ACE DD型基因并AT1R C等位基因的患者心功能较差且左室重量增加。此外，研究结果的差异可能与种族、样本含量及分布、实验方法等因素有关。   

　　总之，心力衰竭的发生和发展在受多个基因以及基因与环境之间相互作用的影响，ACE和AT1R基因参与心力衰竭的发生和发展的机制仍未明了，有待于进一步的深入研究。

　　参考文献:    

　　［1］ Eugene Braunwald，Michael R.Bristow.Congestive heart failure:fiftyyears of progress［J］.Circulation，2000，102:IV14～23.   

　　［2］Tiret L，Rigat B，Visvikis S，et al.Evidence，from combined segregation and linkage analysis，that a variant of the angiotensin I-converting en-zyme（ACE）gene controls plasma ACE levels［J］.Am J Hum Genet，1992，51:197～205.   

　　［3］Andersson B，Sylven C.The DD genotype of the angiotensin-converting enzyme gene is associated with increased mortality in idiopathic heart failure［J］.J Am Coll Cardiol，1996，28:162～167.   

　　［4］Bonnardeaux A，Davies E，Jeunemaitre X，et al.Angiotensisn II type1re-ceptor gene polymorphisms in human essential hypertension［J］.Hyperten-sion，1994，24:63～69.   

　　［5］Andersson B，Blange I，Sylven C.AngiotensinⅡ-type1receptor gene polymorphism and long-term survival in patients with idiopathic congestive heart failure［J］.European Journal of heart failure，1999，1（4）:363～369.     

　　作者单位:

　　1.海南省人民医院心血管中心，海南海口 570311;

　　2.美国匹斯堡大学医学中心心血管研究所.