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p38 MAPK在局灶性脑缺血大鼠缺血中心区和半影区的表达

来源:滨州医学院学报 作者:蒋淑君 杨丽娟 刁汇玲 王 华 2011-6-30

摘要: 【摘要】 目的 研究大鼠局灶性脑缺血不同缺血时间皮质半暗带和中心区p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平和蛋白水平的表达。方法 用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型, 分别于术后1、3、6、12、24 h剥取缺血半暗带及中心区皮质组织,应用Western blot并结合Gel Doc凝胶成像系统,定量检测p38 MAPK磷酸化水平和蛋......


【摘要】  目的 研究大鼠局灶性脑缺血不同缺血时间皮质半暗带和中心区p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平和蛋白水平的表达。方法 用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型, 分别于术后1、3、6、12、24 h剥取缺血半暗带及中心区皮质组织,应用Western blot并结合Gel Doc凝胶成像系统,定量检测p38 MAPK磷酸化水平和蛋白表达量。结果 与假手术组相比,模型组大鼠皮层缺血核心区和半影区p38 MAPK磷酸化水平显著升高(P<0.05,n=6),缺血中心区p38 MAPK在缺血6 h磷酸化程度达高峰,半暗带在3 h时达高峰;各组间p38 MAPK蛋白表达量水平无明显变化。结论 p38 MAPK磷酸化激活参与了大鼠脑缺血损伤过程的信号转导,在缺血中心区和半影区的磷酸化增强可能与局部脑缺血损伤的神经元坏死和凋亡过程有密切关系。

【关键词】  局灶性脑缺血;缺血中心区;半影区;p38丝裂原激活蛋白激酶

Expression of p38 MAPK in cerebral ischemia core and penumbra in rats with focal cerebral ischemia

  JIANG Shujun YANG Lijuan DIAO Huiling WANG Hua

  Department of Physiology ,Binzhou Medical University,Binzhou 256603

  【Abstract】 Objective To investigate the expression of phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase (pp38 MAPK) and protein expression levels at different ischemic time point in focal cerebral ischemic core and penumbra of rats.Methods Focal ischemic models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats were made by inserting nylon thread.Brain samples were harvested from ischemic core and penumbra. Western blot combined with Gel Doc imagine systems were applied to examine the changes in pp38 MAPK and protein expression levels in the brain of rats.Results Western blot results showed that phosphorylation levels of p38MAPK in the ischemic core and penumbra increased significantly at every ischemic time point when compared with sham group (P< 0.05,n=6 for each group). pp38 MAPK peaked at 6 hours in core ischemia and at 3 hours in penumbra. However,there were no significant changes in p38 MAPK protein expression levels.Conclusion The activiated p38 MAPK may be involved in the signal transduction pathway of cerebral ischemia.The increase of pp38 MAPK in the central area of ischemia and penumbra may play a role in neuronal necrosis and apoptosis.

  【Key words】 focal cerebral ischemia,ischemic penumbra field,central area of ischemia,p38 MAPK

  脑缺血性损伤是常见的病理生理过程,近来研究发现脑缺血导致丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族的迅速激活。MAPK途径是细胞外信号引起细胞核反应的共同通路。p38 MAPK是MAPK家族的3个主要成员之一,多种细胞外刺激如应激、细胞因子以及G蛋白耦联受体的激活等均可导致p38 MAPK的磷酸化,从而激活p38 MAPK信号通路[1]。在神经系统p38 MAPK存在于大脑皮质、海马、小脑及脑干等脑区的神经核团,参与神经系统不同区域的生理功能[2]。有研究表明, p38 MAPK通路与包括脑缺血、缺氧等多种因素所导致的脑损伤有密切关系。我们采用大鼠大脑中动脉栓塞术建立局灶性脑缺血动物模型,利用Western blot技术,动态观察了皮质缺血中心区及半影区p38 MAPK蛋白的表达以及其磷酸化的时相变化,以探讨局部脑缺血损伤中p38 MAPK的作用,为临床上有效防治局灶性脑损伤提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料 健康雄性SD大鼠,体重(300±10)g,购自军事医学科学院。pp38磷酸化单克隆抗体(一抗,Cell Signaling公司)和p38总抗体(一抗, Cell Signaling公司),鼠源性βactin 单克隆抗体(一抗,美国Sigma公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体和山羊抗鼠抗体( 二抗, Chemicon 公司),ECL反应底物(Chemicon 公司)和Gel Doc 凝胶成像分析系统(美国BioRad 公司),BCA 蛋白定量试剂盒(美国PIERCE 公司),Kodak BioMaxMR X光片( 美国Kodak 公司),蛋白酶抑制剂(AEBSF,leupeptin,aprotinin,pepstatin A,chymostrypsin)、磷酸酶抑制剂(KF, okadaic acid,sodium pyrophosphate,sodium orthovanadate)、sodium deoxycholate、DTT、NP 40、EDTA、EGTA、TTC等试剂(美国Sigma 公司)。

  1.2 局灶性脑缺血损伤模型的建立 采用大鼠大脑中动脉栓塞术(middle cerebral artery occlusion ,MCAO)。大鼠随机分成假手术组(n=6)和手术组(n=30)。10%的水合氯醛腹腔内注射麻醉(0.3 ml/100 g) ,仰卧位固定,颈正中切口,逐层分离,暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉;为避免刺激迷走神经,电凝切断颈外动脉分支,结扎并游离颈外动脉主干的一段备用;沿颈内动脉头端分离、显露并结扎翼腭动脉,在颈外动脉残端剪一小口,用直径0.25 mm 的尼龙线栓(预先用硅胶均匀涂于头端5 mm) 插入颈外动脉,经颈总动脉分叉置入颈内动脉,深度(18.0±0.5)mm ,直到有轻微阻力感为止。将预置在颈总动脉远端的丝线缚紧,以防线栓滑出和出血。整个手术过程中室温保持在22~25 ℃。假手术组动物在麻醉后只做颈部切口,分离出颈部血管,然后缝合切口。

  1.3 全细胞蛋白的分离提取 手术组动物在术后1、3、6、12、24 h以10%水合氯醛腹腔麻醉后断头,迅速取栓塞侧皮层缺血核心区、半影区,根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法[3],缺血侧大脑半球距离嗅球尖端7~11 mm ,矢状裂至外侧裂下2/3 的皮质由于仅有大脑中动脉供血,梗塞出现早而完全,代表缺血中心区;上1/3 皮质由大脑前动脉和大脑中动脉双重血供,缺血较轻,代表缺血半影区。正常对照组取左侧外侧裂下2/3 的皮质,每个时间点n=6,液氮储存,按每mg组织10 μl的比例加入全细胞裂解液( mmol/L: TrisCl 50, pH 7.5,EGTA 2, EDTA 2, DTT 1,sodium pyrophosphate 5,sodium vanadate 0.1,KF 50,okadaic acid 5×10- 5, 5 mg/L each of leupeptin, aprotinin,pepstatin A ,chymostrypsin, 1% NP40)。匀浆、超声破碎, 使组织细胞全部溶解后, BCA 法蛋白定量, 并制备成蛋白含量为6 μg/μl 的电泳样品。

  1.4 p38 MAPK磷酸化的检测 从上述制备的样品中, 取10 μl (60 μg总蛋白) 用10% 的SDSPAGE 进行电泳,电泳条件: 4℃, 电流20~30 mA。电泳结束后,进行蛋白质转膜, 转膜条件:孔径为0.22 μm 的硝酸纤维素膜(NC膜),4℃,电流400 mA,转膜3 h。Western blot杂交步骤如下:10%脱脂牛奶封闭NC膜1 h,TTBS(20 mmol/L TrisHCl,pH 7.5; 0.15 mmol/L NaCl;0.05%Tween20) 漂洗3次,每次10 min。首先与磷酸化p38 MAPK一抗(1∶500)杂交反应3 h, 4℃过夜,TTBS漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)杂交反应2 h。最后,用TTBS 漂洗NC膜3次,每次10 min,加入ECL试剂反应5 min后,保鲜膜包裹,暗室进行X光胶片曝光、显影和定影,获得磷酸化的p38MAPK蛋白印迹结果。然后,同一张NC 膜,再与总p38 MAPK抗体(1∶1 000)进行第二次Western blot杂交反应,并获得总p38 MAPK蛋白印迹结果。最后,同一张NC 膜,再与βactin (1∶1 000)进行Western blot杂交反应, 并获得βactin 蛋白印迹结果。将得到的X 光胶片上的实验结果,用Gel Doc 凝胶成像分析系统扫描分析。

  1.5 实验数据处理 实验结果应用Gel Doc凝胶成像系统中的Quantity One图像分析软件进行半定量分析。p38 MAPK磷酸化水平的表示方法:由Quantity One图像分析软件分析得出磷酸化及总p38 MAPKX光片上的灰度值。首先,计算出磷酸化p38 MAPK与总p38 MAPK灰度值的比值,并以假手术组的比值作为1,其余各组与假手术组相比,用所得数值表示p38 MAPK磷酸化水平。p38 MAPK蛋白表达量的表示方法:对总p38 MAPK和相应的βactin条带灰度进行分析,以βactin为内参,以假手术组的蛋白表达量为1,算出各组p38 MAPK蛋白表达量。

  1.6 统计学处理 实验数据用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析(One Way ANOVA),结果以x±s表示,差异显著性水平P<0.05。

  2 结果

  2.1 局灶性脑缺血大鼠缺血半影区和中心区p38磷酸化水平的变化 缺血中心区各时间点p38 MAPK磷酸化水平持续处于高水平,1 h即为对照组1.6倍,6达高峰为2.1倍,24 h仍维持较高的表达水平,与正常对照组相比均有显著差异(P<0.05,n=6)。皮质缺血半影区p38 MAPK磷酸化水平,1 h即为对照组1.7倍,高峰出现在缺血后3 h为正常对照的2.6倍,6~24 h表达量有降低,但均高于正常对照组(P<0.05,n=6)。

  2.2 局灶性脑缺血大鼠缺血半影区和中心区P38蛋白表达量的变化 各时间点皮质缺血中心区总p38 MAPK蛋白表达量保持相对恒定,与正常对照组相比没有明显变化(P>0.05)。同样,皮质缺血半影区中p38 MAPK蛋白表达量亦无明显变化。Western blot的结果见表1、2。表1 MCAO大鼠脑缺血中心区组织内p38 MAPK磷酸表2 MCAO大鼠脑缺血半影区组织内

  3 讨论

  脑缺血性损伤是常见的病理生理过程,局灶性脑缺血组织损伤可分为缺血中心区和半暗带区。缺血中心区,其发展至不可逆损伤的速度相当快,在1 h或更短的时间内;缺血半暗带区,其发展至不可逆性损伤的速度较慢,需经数小时甚或1 d[4]。挽救缺血半暗带是治疗的关键所在。脑缺血后神经细胞死亡由坏死和凋亡共同引起,Murakami 等 [55]的实验证明,永久性脑缺血与短暂性脑缺血细胞凋亡的出现时间及解剖分布具有相同特点,细胞凋亡均集中于半暗带或移形区,细胞凋亡与坏死并存于梗死灶中。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一组丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活的蛋白激酶,是细胞应激和损伤反应的主要信号通路蛋白,可将细胞外刺激信号传递至细胞核。p38 MAPK是MAPKs亚家族成员之一(其它两个亚家族分别是细胞外信号调节激酶和cJun N末端激酶,简称为ERK和JNK),p38 MAPK 途径由紫外线、渗透压变化、细胞因子和生理应激等激活,因此又称为MAPK应激信号通路,在应激反应如炎症、细胞凋亡中发挥重要作用[6]。近来研究发现脑缺血导致丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK) 家族的迅速激活。 Takagi等[7]发现,局灶性脑缺血再灌注后5 min,皮质及海马的神经元中p38 MAPK,JNK 活性开始增强,再灌注30 min 达到高峰,而再灌注后72 h ,上述激酶活性增强的区域中可发现凋亡的神经元。Kevin 等[8]在沙土鼠脑缺血模型发现,p38 MAPK及其底物ATF2 ,MAPKAP2 在脑缺血后持续数天活化,缺血后3~4 d酶活性最高,同时海马区锥状神经元同期缺损最多,而JNK1 和ERK的活化不明显。另有实验显示,通过抑制p38 MAPK 通路可显著减少大鼠脑缺血后海马CA1 区的凋亡神经元[9]。这进一步说明p38 MAPK 的活化与神经元的凋亡密切相关。p38 MAPK激活后通过何种机制导致神经元死亡,尚无定论,但已经知道, p38 MAPK被磷酸化激活后,可以进一步激活其下游的激酶或多种转录因子, 如蛋白激酶MAPKAPK2、转录因子ATF2、Elk1等,产生一系列细胞内效应,从而诱导一些特定基因的表达,包括诱导型一氧化氮合酶、选择素、TNFα、IL1β等。这些基因表达产物在脑缺血损伤时的神经细胞凋亡、炎性反应等过程中发挥着重要作用。

  有关p38 MAPK磷酸化激活及蛋白表达的时相问题, Wu 等[10]报道小鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion , MCAO)后5、10、30 min,缺血区的神经元及星形胶质细胞内SAPK/JNK、p38 MAPK、ERK1/2 开始分别被激活,缺血后2 h 达峰值时,MAPK活性分别增加了4.8、3.7及2.7倍。Ferrer等[11]发现在缺血早期,p38MAPK、ERK和JNK的下游底物CREB、ATF2、Elk、 cmyc和cjun的磷酸化水平发生了明显的改变,但在不同缺血区域,其变化不同。如ATF2和cmyc的磷酸化水平在缺血灶的中心明显降低而在缺血半影区则升高。我们实验Western blot的结果显示,在正常大鼠皮层中检测到了pp38 MAPK, p38 MAPK和βactin蛋白的表达,其中p38 MAPK和βactin有较高的表达水平,而pp38 MAPK仅有微弱的表达,但缺血后脑组织p38 MAPK磷酸化水平明显增高。缺血中心区1~24 h p38 MAPK磷酸化水平持续处于高水平,6 h达峰值。在皮质缺血半影区,p38 MAPK磷酸化的高峰出现在缺血后3 h为正常对照的2.6倍,6~24 h表达量有降低,但24 h时仍为正常对照的1.4倍,而总p38 MAPK蛋白表达量各脑区和时间点无明显变化。提示脑缺血后p38 MAPK磷酸化激活而不是蛋白表达量的变化参与神经细胞死亡过程的调节,p38 MAPK磷酸化激活可能介入了脑缺血后的早期神经元损伤,在缺血早期(3~6 h之内)抑制p38 MAPK磷酸化激活,可能会对半影区神经细胞产生保护作用。

  我们的研究初步观察了局部脑缺血不同脑区的p38 MAPK被激活及时相特点,激活后的p38 MAPK表达于哪种特异的神经细胞,p38 MAPK的激活在脑缺血性损伤中的作用如何等还需要进一步的研究。

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