当前位置:首页 > 医源资料库 > 在线期刊 > 滨州医学院学报 > 2009年第32卷第4期 > 新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义

新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义

来源:滨州医学院学报 作者:张定荣张海鸿 车芬芳徐书珍 2010-1-13
336*280 ads

摘要: 【摘要】 目的 观察新生鼠窒息后缺氧缺血再灌注损伤不同时间脑组织NFκB动态变化,以探讨NFκB信号途径在新生儿窒息脑损伤中的作用。方法 出生7 d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组)。制备新生鼠窒息模型,并于窒息后1、3、5和7 d取脑组织行石蜡切片。采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织NFκ......


【摘要】  目的 观察新生鼠窒息后缺氧缺血再灌注损伤不同时间脑组织NFκB动态变化,以探讨NFκB信号途径在新生儿窒息脑损伤中的作用。方法 出生7 d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组);制备新生鼠窒息模型,并于窒息后1、3、5和7 d取脑组织行石蜡切片。采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织NFκB p65活性表达水平,用苏木精伊红染色观察窒息后脑组织形态学变化。结果 B组脑组织NFκB的表达较A组显著增强(P<0.05),以5 d时升高最明显;并伴有神经细胞坏死及凋亡现象。结论 NFκB可能通过炎症反应机制介导窒息脑损伤过程。

【关键词】  NFκB;窒息;新生鼠;缺氧缺血再灌注损伤; 脑组织

The expression and significance of NFκb in hypoxia ischemia reperfusion brain injury of newborn rats with asphyxia

  ZHANG Dingrong1 ZHANG Haihong2 CHE Fenfang1 et al

  1 Department of Pediatrics,People's Hospital of Jimo 266200;2 Department of Pediatrics,Affiliated Hospital of

  Binzhou Medical University

  【Abstract】 Objective To observe the activation of NFκB in hypoxia ischemia reperfusion brain injury of newborn rats with asphyxia. The aim of study is to explore the effect of NFκB signal pathway on brain injury of newborn with asphyxia, so as to provide the experimental base for finding clinical treatment of asphyxia,in which NFκB is taken as the target.Methods newborn rats(7 days old)were randomly divided into control group (A) and asphyxia group (B).The model of asphyxia was induced in B group .Immunohistochemical method was used to detect the activity of NFκB P65 in the brain of the newborn rats,and hematoxylineosin staining was perform ed to observe the histological evidence of asphyxia in the brain.Results The activity of NFκB P65 was higher in group B than that in group A(P<0.05),increased to the highest peak at 5 d,with nerve cell death and apoptosis in group B.Conclusion The NFκB,may play an important role in brain injury with asphyxia.

  【Key words】 NFκB,asphyxia, newborn rats, hypoxia ischemia reperfusion, brain tissue

  脑组织中的NFκB能被许多因素激活,其中包括窒息后脑组织缺氧缺血再灌注损伤。近年来的研究发现NFκB还存在于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞中,在调节炎症反应的基因中起关键作用,与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关[1]。本实验建立新生鼠窒息动物模型,旨在探讨NFκB信号途径在新生鼠窒息中的作用,为进一步治疗新生儿窒息提供新的思路。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物及分组 七日龄Wistar大鼠25只,由青岛市市立医院动物中心提供,雌雄不限,体重12~20 g。按同窝随机分成两组:对照组5只(A组),窒息组(B组)20只,窒息组又分为4个亚组(Ba、Bb、Bc、Bd),即分别于窒息后1、3、5和7d处死动物,每个时相点各5只。各组间体重无显著性差异(P>0.05)。

  1.2 动物模型的建立 ①窒息动物模型:为更接近新生儿窒息病理过程(缺氧缺血再灌注损伤),根据新生鼠常压窒息模型[2],将实验动物分别置于容积为55 ml的缺氧瓶(即磨口瓶,保证密闭性)中,内装0.005 kg钠石灰,待动物安静后,塞紧瓶塞,密闭30 min后,立即氧罩吸氧2 h(氧浓度50%~60%),之后放回笼中,仍由母鼠哺乳喂养。②对照组动物模型:模拟上述过程不塞紧瓶塞,仍由母鼠哺乳喂养。

  1.3 方法

  1.3.1 标本采集:分别于窒息后1、3、5和7d迅速横断各组新生鼠脊髓,在冰盘上快速取全脑组织,以冰生理盐水清洗至无血迹,切取含有海马组织的脑片,所有标本均经10%的中性福尔马林固定,经58~60℃石蜡包埋后,连续切片2张,厚度为4 μm,烤片30 min,供免疫组化和病理检查用。

  1.3.2 新生鼠脑组织NFκB p65蛋白活性检测:采用免疫组化法,标本测定一次完成。测定步骤:①组织切片;②3%H2O2去离子水孵育;③蒸馏水冲洗;④80%火力微波修复;⑤PBS洗3次;⑥滴加正常山羊血清封闭液;⑦滴加适当稀释的一抗;⑧PBS振洗3次;⑨滴加生物素化二抗工作液;⑩PBS振洗3次;滴加三抗SA/HRP;PBS振洗3次;DAB显色;苏木素复染细胞核;梯度酒精脱水,中性树胶封片。免疫组化同时加作阴性对照片(PBS代替一抗)。

  1.3.3 脑组织形态学检查:苏木精伊红(HE)染色用于观察脑组织形态学改变,脑细胞损伤情况,帮助判断坏死和凋亡细胞。

  1.4 统计学处理 所得数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理,进行多因素方差分析,两组间比较用t检验,P<0.05差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 NFκB p65结果判断 阳性细胞为细胞核染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积,定位于细胞核和细胞浆。由二位病理医生按双盲法对免疫组化结果进行评估,即在高倍镜下(×200)随机观察10个视野,计数1 000个细胞中的阳性细胞数,计算出阳性细胞百分率,免疫组化染色图片见图1、2。

  2.2 脑组织病理学判断 参照图谱[1],①正常神经细胞结构:锥体细胞呈椭圆型,核染色质疏松,核仁清楚;②神经细胞损伤:胞体缩小,呈三角形或长条形,胞核固缩深染,核仁消失,细胞与周围间隙增宽。

  2.3 神经症状评分 从缺氧开始观察24 h,观察异常神经症状并进行评分。评分标准[4]:竖毛震颤,运动减少各计1分;瘫痪、旋转、抽搐各计3分;昏迷计6分。结果见表1。A组无神经系统症状,而B组出现明显神经系统症状(P<0.05),B组各亚组与A组相比均有显著性差异(P<0.05),以Bb及Bc组最显著,Bd组趋于稳定,随时间延长,在一定时间后神经症状可能逐渐好转,但未作进一步观察。

  表1 各组异常神经症状评分 (x±s,n=25) 组别 n 异常神经症状评分 t值 P A 5 0 Ba 5 6.40±1.51 9.657 <0.05Bb 5 8,42±1.32 8.625 <0.05Bc 5 9.84±2.10 12.624 <0.05Bd 5 8.24±1.63 10.032 <0.05 2.4 病理检查 A组:外观及病理检查均正常。B组:肉眼观察脑表面苍白,切面上可见水肿,偶见点状出血。HE染色光镜下见各亚组不同程度组织形态学改变,见炎细胞浸润,细胞水肿,变性,及坏死现象;细胞皱缩,细胞核固缩,胞浆疏松,结构不清等凋亡改变。

  2.5 脑组织NFκB p65蛋白活性表达(见表2) A组:活性表达为6.00±1.58。B组:各时相点与对照组比较活性均有增加(P<0.05),见表2。实验1 d即增高,实验第5天升高最明显,为A组的5~6倍,7 d已开始降低;不同时间点之间除3 d组和5 d组之间无统计学意义外,其他各时相点之间均有显著性差异(P<0.05)。表2 A组与B组NFκB p65阳性细胞比较

  2.6 脑组织NFκB p65蛋白活性表达与病理改变之间的关系 NFκB p65蛋白活性与病理改变不一致,NFκB p65蛋白活性在Ba、Bb、Bc呈逐渐增加,Ba、Bb组细胞坏死现象明显,Bc、Bd组细胞凋亡现象逐渐明显。Bd组NFκB p65蛋白活性已开始下降,神经细胞凋亡现象也趋于稳定。

  3 讨论

  核因子κB(nuclear factor kappa B,NFκB)是一种重要的转录因子,存在于真核细胞中,具有广泛的生物活性,激活后可促进许多细胞因子、黏附分子等基因的转录,在机体的免疫应答、炎症反应和细胞的生长发育等方面发挥着重要作用 [4]。在窒息所造成的缺氧、缺血过程中,恢复血流可避免细胞死亡和组织损伤,但在长时间严重缺氧、缺血基础上,恢复血流会引起更剧烈的损伤,即再灌注损伤。本研究表明,新生鼠窒息30 min,复氧1、3、5和7 d四个时相点,NFκB的活性均明显增高,说明在窒息新生鼠脑组织存在NFκB激活。Stephenson等[5]用凝胶电泳迁移分析试验发现脑缺血再灌注0.5 h后NFκB的活性即明显升高,6 h达到高峰,24 h降到1 h的水平。本实验表明NFκB在窒息复氧后1 d即明显升高,5 d时达高峰,以后逐渐下降,但7 d时仍明显高于对照组。造成两者试验结果有差异的原因可能与动物模型不同,缺氧缺血时间不同,引起的缺血程度以及再灌注时间与程度不同有关。本研究发现NFκB与神经细胞损害病理改变密切相关,随着NFκB的升高神经细胞损害,坏死及凋亡现象明显,早期以细胞坏死为主,后期则已调亡为主。7 d时NFκB开始下降,病理改变也趋于稳定好转。说明NFκB参与了这一病理损害过程,NFκB的激活可能对病理改变的控制和恢复有促进作用。

  NFκB在神经系统中广泛表达,细胞受到外界刺激,如:炎症、创伤、缺血再灌注等损伤后NFκB激活,在脑缺血再灌注损伤中NFκB可被许多因子激活,包括炎症细胞因子TNFα、IL1、氧自由基和细胞内钙增加等[6]。

  本试验证明窒息新生鼠海马区凋亡增加,且伴随着NFκB活化表达的增高,提示窒息后NFκB的激活与细胞凋亡有关。Schneider等[7]为了研究NFκB在神经元死亡中的作用,观察了啮齿动物卒中模型的NFκB的活性,发现在缺血半球NFκB被激活的p50敲除鼠,缺血损害显著减轻。缺血缺氧后神经细胞的死亡主要分为早期的坏死和继发性细胞凋亡,本研究Ba、Bb组以坏死为主,Bc、Bd组以调亡为主也证明了这一点。NFκB的活化对阻止细胞凋亡,改善病理变化的有力的炎性机制反应。缺血缺氧损伤后机体通过抗损伤机制在一定程度上诱导NFκB的活化来对抗损伤,随着损伤的稳定好转NFκB也由于刺激减弱而活性降低。

  新生儿窒息可导致新生儿脑缺氧缺血损伤,病死率和后遗症率高,是新生儿期造成伤残儿童的主要原因之一。据此推测NFκB的活化与新生儿窒息后脑损害相关,NFκB的活性可能对避免或减轻窒息后脑损害有治疗作用。

【参考文献】
    [1] Nolan B,Collette H,Baker S,et al.Inhibition of neutrophil apoptosis after severe trauma is NF kappa beta dependent[J].J Trauma,2000,48(4):599604.

  [2] 董文斌,冉隆瑞,冯志强,等.生脉注射液对窒息后脑损伤保护作用的研究[J].中华儿童保健杂志,1998,6(1):3234.

  [3] Barnes PJ,Karin M.Nuclear factor NFκB pivotal transcription factor in chronic inflammatory disease[J].N Engl J Med,1997,17:39.

  [4] Seegers H, Grillon E, Trioullier Y,et al.Nuclear factor kappa B activation in permanent intraluminal focal cerebral ischemia[J].Cere Blood Flow Metab,2000,20(3):592594.

  [5] Stephenson D, Yin T, Smalstig EB,et al.Transcription factor Nuclear Factor kappa B is activated in neurons after focal cerebral ischemia[J].Cere Blood flow Metab,2000,20(3):592603.

  [6] Rroll JE,Howard EF,Hess DC,et al.Nuclear factorκb activation during cerebral reperfusion effert of attenuation with Nacetylcysteine treatment[J].Brain Res Mol Brain Res,1998,56(12):186191.

  [7] Schneider A,MartinVillalba A.NFkappa B is activated and promotes cell death in cerebral ischemia[J].Nat Med,1999,5(5):554559.


作者单位:1 即墨市人民医院儿科 266200;2 滨州医学院附属医院儿科;3 青岛市市立医院儿科


医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: