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维生素A缺乏干眼症模型兔泪液分泌及泪膜稳定性的改变

来源:INTERNET 作者:马轶群 王传富 2005-6-23
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摘要: 【摘要】 目的 观察维生素A(VitA)缺乏干眼症模型兔眼表及泪膜的变化,评价其对泪液分泌及泪膜稳定性的影响。 方法 健康兔9只以VitA完全缺乏饲料喂养,于实验前和实验后2、3、4、5、6个月行Schirmer试验、泪膜破裂时间及虎红染色检测。6个月后处死所有动物,取泪腺、角膜及结膜行病理学观察。病理学观察,实验兔泪腺见多......


  【摘要】 目的  观察维生素A(VitA)缺乏干眼症模型兔眼表及泪膜的变化,评价其对泪液分泌及泪膜稳定性的影响。 方法  健康兔9只以VitA完全缺乏饲料喂养,于实验前和实验后2、3、4、5、6个月行Schirmer试验、泪膜破裂时间及虎红染色检测。对照组9只兔喂以正常饲料。6个月后处死所有动物,取泪腺、角膜及结膜行病理学观察。 结果  实验组Schirmer试验、泪膜破裂时间明显低于实验前,且随观察时间延长差异有显著性(P<0.05)。虎红染色实验后呈阳性,实验前呈阴性。病理学观察,实验兔泪腺见多数萎缩的腺细胞,腺泡腔内分泌黏液明显减少,角膜上皮层次增加,排列紊乱,结膜杯状细胞几乎不见。 结论  VitA缺乏兔泪腺上皮细胞萎缩,角膜上皮角化,结膜杯状细胞减少,导致泪液分泌的质和量改变及泪膜稳定性降低而发生干眼症。

    Changes of tear secretion and tear film stability in vitamin A deficient rabbit with experimental xerophthalmia

    Ma Yiqun,Wang Chuanfu,Wang Xiu

    Department of Ophthalmology,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao266003.

    【Abstract】 Objective To evaluate the effect of vitamin A on tear secretion and tear film stability by observing the changes of oculus surface and tear film in vitamin A deficient rabbits.Methods 9rabbits were fed by vitamin A de-ficient forage and9control rabbits were fed by normal forage.Schirmer's test,tear film break-up time and rose bangle staining were performed on the eyes of the models before and after experiment at2、3、4、5and6months.Lacrimal gland,cornea and conjunctiva were removed for histopathological observation after6months.Results Both Schirmer's test and tear film break-up time scores were significantly lower in the vitamin A deficient models after experiment than before.The difference became more and more prominent in the course of observation.Rose bangle staining was positive after the experiment.Histopathological observation was characterized by lacrimal glands atrophy,cornea keratinization of the corneal epithelium,less of goblet cells from the conjunctival epithelium and so on.Conclusion The deficiency of vita-min A might contributes to the atrophy of lacrimal gland epithelium,the keratinization of corneal epithelium and the sig-nificant decrease of the number of conjunctival goblet cells.All these could lead to decrease of both the quantity,quality of tear secretion,thus cause the instability of tear film and xerophthalmia.

    Key words vitamin A tear film pathology xerophthalmia

    正常眼表有一层泪膜覆盖,分3层:最内层为眼表上皮分泌的黏液层,中间为泪腺分泌的水样层,最外层为睑板腺分泌的脂质层。稳定的泪膜可保证眼表的舒适及屈光表面,维持眼表上皮(角膜、角膜缘及结膜)的健康,同时可作为抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。泪膜与眼表上皮间的良好关系是确保眼表面健康的必要条件 [1] 。笔者通过以维生素A(VitA)完全缺乏饲料喂养兔制作干眼症模型,观察泪膜与眼表的病理变化,评价其对泪液分泌及泪膜稳定性的影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 取健康1个月龄新西兰白兔18只(由青岛市实验动物中心提供),体重(0.5±0.2)kg,雌雄兼用。随机分为实验组和正常对照组,每组9只。

    1.2 模型制作方法 以干酪素(Casein,上海伯奥生物科技有限公司提供)为主的VitA完全缺乏饲料喂养实验兔6个月,饲料配方参照AOAC [2] (见表1)。对照组喂以正常饲料,含VitA1200μg/kg。

    表1 维生素A完全缺乏饲料成分 (略)注:a:vitamin mix(in1kg diet):cholecalciferol7.5μg,α-tocopherol acetate150mg,menadione5mg,thiamin-dichloride5mg,riboflavin10mg,pyridoxine hydrochloride6mg,nicotinic acid20mg,Ca-D-pantothenate50mg,choline chloride1000mg,folic acid200μg,vitamin B 12 25μg.b:mineral mix(in1kg diet):CaHPO 4 500g,NaCl74g,K 3 C 6 H 5 O 7 ·12H 2 O220g,K 2 SO 4 52g,Mn-CO 3 3.5g,Ferric citrate15g,CuCO 3 0.3g,KIO 3 0.01g,Na 2 SeO 3 ·5H 2 O0.01g,ZnCO 3 1.6g,KCr(SO 4 ) 2 ·12H 2 O0.05g

    1.3 泪液分泌及泪膜稳定性检查 检查均由同一人完成,每次检查时间、地点、照明亮度、湿度及温度相同。于实验前和实验后2、3、4、5、6个月行Schirmer试验、泪膜破裂时间(break-up time,BUT)检测及虎红角结膜活体染色检测。Schirmer试验:用5mm×35mm的Whatmean41号滤纸条,折出5mm置于下穹隆结膜囊内的外1/3处,其余部分突出眼外。5min后测量滤纸湿润长度(不包括反折)。BUT检测:用玻璃棒蘸荧光素滴于兔下睑结膜囊内,于裂隙灯下用钴蓝光照射,检查从最后1次瞬目开始,记录泪膜上出现第1个破裂点(黑斑)的时间。虎红角结膜活体染色检测:用玻璃棒蘸虎红滴于兔下睑结膜囊内,于裂隙灯下观察,规定角膜染色点<3点为正常,>4点为可疑异常;仅睑裂部角结膜染色为(+),累及下方球结膜为(++),累及上方球结膜为(+++) [3] 。

    1.4 组织病理学观察 将饲养6个月后的对照组及实验组兔经耳缘静脉推注空气处死,立即摘除其双眼泪腺、角膜及结膜,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,做4μm连续切片行HE染色,光学显微镜观察。

    1.5 统计学方法 计量资料采用(ˉx±s),组间比较采用SPSS6.0软件包进行t检验。以P<0.05为差异有显著性。

    2 结果

    2.1 泪液分泌及泪膜稳定性检查 VitA缺乏模型兔喂养6个月后,体重较对照组轻,体型较小,毛发粗糙,角膜干燥无光泽,见灰白色溃疡灶,荧光素呈点状及片状染色(见图1)。Schirmer试验:模型兔喂养4个月起,泪液浸湿试纸长度较实验前短,且随观察时间延长差异有显著性,P<0.05(见表2)。BUT检测:模型兔喂养4个月起,泪膜BUT较实验前缩短,且随观察时间延长差异有显著性,P<0.05(见表3)。虎红角结膜活体染色检测:模型兔喂养3个月起,虎红染色呈阳性,且随时间加重,实验前呈阴性(见表4)。

    表2 VitA缺乏模型兔实验前后Schirmer试验试纸浸湿长度测定的比较 (略)

    表3 VitA缺乏模型兔实验前后BUT检测的比较 (略)

    表4 VitA缺乏模型兔实验前后虎红角结膜活体染色情况(略)

    2.2 组织病理学观察

    2.2.1 正常对照组 泪腺上皮细胞为高柱状,核居基底部,腺上皮细胞近腔间有大量分泌泡状黏液,腺泡腔内可见泡状黏液(见图2)。角膜上皮浅层为2~3层鳞状上皮细胞,中间层为1~2层翼状上皮细胞,基底层1层为立方形上皮细胞(见图3)。结膜可见排列整齐的柱状上皮,核椭圆淡染,其间见富含分泌颗粒的杯状细胞(见图4)。

    2.2.2 实验组 泪腺见多数萎缩的腺细胞,近腔间及腺泡腔内分泌泡状黏液明显减少(见图5)。角膜上皮层次增至7~9层,细胞弥漫性肿胀,排列较紊乱;表层细胞形态不规则,更加扁平,细胞核小而扁平;翼状细胞形状变扁,面积变大,胞质密度增加;基底层增生变厚,细胞核小而染色深(见图6)。结膜上皮细胞扁平增大,细胞层数明显增多,杯状细胞极少(见图7)。

    3 讨论

    VitA是第一个被发现的维生素,1915年McCol-lum及Davis从动物油及鱼油中分离出一种可以维持和促进动物生长的物质,并证明如仅以精磨米、酪蛋白及矿物质饲喂动物,不能使其发育正常,而在加入这种脂溶性物质后可正常生长,并命名为脂溶性A,即VitA [4] 。它参与合成角膜糖蛋白,刺激葡萄糖和氨基葡聚糖掺入角膜上皮;诱导基质层纤维母细胞cDNA合成增加;参与角膜的能量代谢;影响结膜转分化(transdifferentiation);诱导角膜内皮细胞表面表皮生长因子受体表达增加,对表皮生长因子促进角膜创伤愈合有增强效应;对于维持正常的视觉功能及免疫系统的完整性是必不可少的 [5] 。VitA缺乏时角膜上皮不能正常生长与分化,鳞状角化细胞比例增加,周密性下降。角膜基底层增生变厚,细胞分裂加快,合成张力原纤维和桥粒增加,使表面层细胞变扁,变为无核的角化细胞,由被角质原纤维所填充的角质透明质构成。基底细胞一旦发生角化,实际上就是终止它的分化,标志着角膜上皮的衰老和死亡。角膜上皮对VitA缺乏有一定阈值,VitA稍低于此值即可使角膜跃入角化状态。 VitA缺乏可使结膜失去杯状细胞,使结膜上皮角化、增厚和鳞状化生。VitA缺乏可导致泪腺分泌细胞比例下降,腺体萎缩 [6] 。WHO建议以下列记号表达缺乏状况 [7] :X1A—结膜干燥;X1B—Bitot斑;X2—角膜干燥;X3A—角膜干燥及溃疡;X3B—角膜软化;XN—夜盲;XF—眼底症状,见于视盘上如种子粒状突起的白色病灶;X5—角膜瘢痕。本研究以此为依据制作了VitA缺乏兔干眼症模型,模型兔喂养6个月后,体重较对照组轻,体型较小,毛发粗糙,角膜干燥无光泽,见灰白色溃疡灶。经传统临床检查发现,模型兔实验后Schirmer试验、泪膜破裂时间明显小于实验前,且随观察时间延长差异有显著性。虎红染色实验后为阳性,实验前为阴性。说明VitA缺乏兔泪液分泌减少、泪膜稳定性下降、角膜表面染色,可诊断为干眼症。VitA缺乏可导致干眼症发生。本研究结果表明,模型兔泪腺腺体萎缩、结膜丧失杯状细胞、角膜上皮角化,这些改变均由VitA缺乏引起。泪腺萎缩导致泪膜水样层减少,结膜杯状细胞减少导致泪膜黏液层减少,于是泪膜成分改变、泪膜稳定性破坏,最终引起眼表干变而发生干眼症。随病变发展,淋巴细胞浸润导致角膜水肿和血管增生,鳞状细胞变混浊和致密化,严重时淋巴细胞释放胶原酶使角膜基质在表皮下溶解,表层坏死组织脱落形成溃疡。Van Horn等 [8] 将VitA缺乏干眼症分为5级:1级:角膜上皮失去光泽变灰暗;2级:角膜上皮点状糜烂并逐渐融合;3级:早期角膜角化伴上皮水肿;4级:进行形角化伴有斑状结构;5级:角膜基质水肿,浸润,角膜血管化,伴或不伴继发性角膜溃疡。综上所述,VitA缺乏干眼症模型兔泪腺萎缩,结膜杯状细胞减少,角膜上皮角化,致使泪液分泌的质与量改变,眼表上皮干燥失活,泪膜稳定性降低。(本文图片见附页1)

    参考文献

    1 Tseng SC,Tsubota K.Important concepts for treating ocular surface and tear disorders.Am J Ophthalmol,1997,124:825-835.

    2 美国公职分析化学家协会(AOAC).分析化学手册.北京:中国光学学会光谱委员会,1986,619-622.

    3 张梅,陈家祺,刘祖国.干眼症检查的进展.眼科研究,2001,19:184-187.

    4 何志谦.人类营养学.北京:人民卫生出版社,2000,127-145.

    5 Hatchell DL,Sommer A.Detection of ocular surface abnormalities in ex-perimental vitamin A deficiency.Arch Ophthalmol,1984,102:1389-1393.

    6 Hassell JR,Newsome DA,De Luca LM.Increased biosynthesis of spe- cific glycoconjugates in rat corneal epithelium following treatment with vi-tamin A.Invest Ophthalmol Vis Sci,1980,19:642-647.

    7 Weber F.Biochemical mechanisms of vitamin A action.Proc Nutr Soc,1983,42:31-41.

    8 Van Horn DL,Schutten WH,Hyndiuk RA,et al.Xerophthalmia in vi-tamin A-deficient rabbits:clinical and ultrastructural alterations in the cornea.Invest Ophthalmol Vis Sci,1980,19:1067-1079.

    作者单位:266003山东省青岛市立医院眼科
    青岛大学医学院附属医院眼科


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