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指纹图谱在中药质量控制中的作用与意义

来源:www.chinesemedicines.net 作者:指纹图谱在中药质量控制中的作用与意义 2006-9-18
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摘要: 郑远斌指导:吴锦忠副教授(福建中医学院,350003,福建福州//男,1978年生,2002级硕士研究生)指纹图谱为近年发展起来的一种中药质控手段,有人将其定义为一种综合的、可量化的色谱鉴定手段。借以鉴别真伪,评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性。亦有人认为通过提取中药的特性,结合现代分析手段。将其表现出......


郑  远  斌    指  导:吴锦忠副教授(福建中医学院,350003,福建福州//男,1978年生,2002级硕士研究生)

指纹图谱为近年发展起来的一种中药质控手段,有人将其定义为一种综合的、可量化的色谱鉴定手段;借以鉴别真伪,评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性;其本质属性是“整体性”和“模糊性”。亦有人认为通过提取中药的特性,结合现代分析手段。将其表现出来,所得即为指纹图谱。二者并无本质差别,只是构建方法的范围不一样,本文将立足于后者进行阐述。中药作用的特点是多成分。多靶点.多途径调节人体机能,虽然其具体机理尚不明确,但单一成分的含量测定,显然很难完全反映中医用药所体现的整体疗效。所以。采用指纹图谱能较为宏观地、综合地反映出中药的内在质量已被国内外研究者所认可。近年这方面的研究报道较多,故本文对其进行了综述。

1中药指纹图谱中药指纹图谱的构建构建中药指纹图谱的方法有很多,主要有色谱法、波谱法、x一射线衍射法及分子生物学法。色谱法为目前最常用方法。包括TLC、HPLC、GC、 HSCCC等。薄层色谱具有快速、操作简便、色谱后衍生简单等特点,且能提供色彩斑斓的图像,特别适合我国国情而被广泛应用。但由于其为开放色谱,受外界环境及操作影响较大,重现性较柱色谱差。柱色谱给出的是分辨率高的轮廓色谱,重现性好,操作相对容易。HPLC具较高的分离能力,随着检测器灵敏度、种类的增加如:

UV、ELSD、FPS、DAD等的应用,其适用范围越来越广,已成为最有前途的一种方法。GC则用于含挥发性成分的中药材及其制剂的分析[5-TJ。HSCCC(高效逆流色谱)为近年来发展起来的新技术,具有较高的分离能力,适用范围广,样品预处理要求低。且无固体载体,无须担心样品与载体发生反应,是一种较具前景的质控手段。

波谱法包括UV、IR、NMR、MS。由于UV、IR反映的是化合物的结构信息,具加和性,很难表述中药材或中成药这样复杂体系中各成分浓度分布的整体状况。但借助于计算机分类技术或模糊数学方法进行处理。它们还是可以用于鉴别不同药材的。目前NMR一般用tH—NMR,其图谱具有专属性、全面性、定量性、易辨性等特点,且信息量大,可重复性好,主要用于鉴别植物类药材的真伪优劣[13--14]。但由于其仪器昂贵,应用较少。而MS对于提取液主成分的含量要求较高,一般很少单用,目前多以联用方式出现,如:HPLC—MC{lS3、GC—MS{16-173、LS—MSa83等。

x一射线衍射法具有专属性强、快速。耗样量少等特点,主要用于中药粉末鉴定。目前尚未多见{5,193。分子生物学法其理论基础是生物物种的多样性是其基因多态性的结果,而基因多态性可在分子水平上进行检测。一般方法包括电泳技术、免疫技术和DNA分子遗传标志技术。电泳技术分为蛋白质电泳和高效毛细管电泳。蛋白质电泳主要用于果实及动物类药材的鉴别。而t-IPCE则有着更广泛的适用范围,不但可分析蛋白质,还可分析植物的其他化学成分{213。其还具有高效低耗、抗污染、高分辨等优点,有着很好的发展前景。免疫技术是利用不同科的动物均含有特异性蛋白质,这些蛋白质具免疫特异性,通过免疫反应可鉴别出动物基原来进行工作的。故只适用于动物类药材[20]。而DNA分子遗传标志技术是直接分析生物的基因型而非表现型,特别适用于中药品种鉴定及道地性考察,主要手段有:RAPD、AP—PCR、 PCR—FRFLP等。其中以RAPD最有前景。

指纹谱图的辨析谱图的辨析是对经上述各种方法所提取的中药特性(指纹谱图)进行处理,以确定图谱间的相似性。最常见的为将指纹图谱作为一个“图形”。采取直观对照的方法进行辨认。该方法简便易行.但复杂谱图的结果易受主观影响{223。针对这种情况,有人提出了色谱相对保留值指纹图谱,引入了相对保留指数、重叠率、N强峰等量化参数作为评判谱图的标准(参考文献)。还有人利用化学模式识别方法对此进行研究t23J。化学模式识别方法综合了数学、计算机、化学等各方面知识,能更较客观地反映图谱间的相似程度。主要方法有:主成分分析、非线形映照、聚类分析等。目前利用计算机进行图谱解析的还有人工神经网络识别系统{263及色谱数据可视化技术[10,273等。后者虽较为准确,但对操作者的知识面要求较高,在技术普及上存在不少困难。

2指纹图谱在中药质量控制中的作用

指纹图谱在中药质量控制中有着广泛的用途。对于中药材而言,它可以用来鉴别真伪,评判优劣,区分不同产区、采收时间、炮制方法、用药部位的同种药材;而对于中药制剂,它可以作为产品的质量标准,用以鉴别产品真伪,控制产品批间质量差异。评价工艺的合理性。但就目前而言。以在中药材中的应用为最多。  

鉴别中药材真伪优劣  高良姜含具有生理活性的黄酮类化合物,其中高良姜索努专属成分,对高良姜的黄酮类成分进行薄层色谱指纹图谱研究,建立了高良姜药材的薄层色谱定性鉴别。高良姜素。山  素等8个特征荧光斑点构成了高良姜乙酸乙酯提取部位的薄层色变指纹图谱。该方法可以有效地鉴别高良姜,并评价其质量[28J,且简单易行。金银花为常用药材,以芳樟醇为参照物,采用Gc法对11批样品进行分析,找出特征指纹峰,建立其GC指纹图谱,获得了24个共有指纹峰。该指纹图谱可以作为鉴别金银花药材的检测标准之一。人参、西洋参和三七参的HPLC指纹图谱研究表明,3种参的皂苷类成分均得到很好分离,可有效鉴别人参、西洋参和三七参。对此,国外有人以low—COt DNA为探针也能鉴别这三者。还有人以E—AGG/M—CAA为引物,利用AFLP和DAMD技术。也鉴别了人参、高丽参、西洋参,并发现人参与高丽参较与西洋参相似L32]。DNA技术在鉴定品种方面确有其独到之处。药材厚朴、凹叶厚朴及其常见的伪品、混淆品采用DNA扩增产物指纹分析(DNA amplification fingerprinting,DAF)技术鉴别,根据聚丙烯酰胺凝胶上显示的DNA带型差异可简便地区分出厚朴、凹叶厚朴和其它伪品、混淆品。

区分不同产区、采收时间、炮制方法、用药部位的同种药材21种不同产地的广藿香采用GC—MS法进行主成分分析,发现其11种挥发油主成分的出峰先后顺序及相对含量极具特征性,形成了广藿香特有的指纹图谱,可作为广藿香鉴定和内在质量评价的依据。对不同产地、部位的连翘及其伪品进行了HPLC—FP指纹检测,结果不同的样品均显示了各自的特征,表明该图谱可用于区别不同产地及来源的连翘。黄芪药材用反相高效液相色谱一紫外一质谱联用技术对进行了指纹图谱研究,为阐明不同产地药材的异同性,建立黄芪质量的国际统一标准奠定基础C15J。另外利用RAPD技术对全国四大商品区的中药牛蒡子生品和其中两个商品区的制品进行了DNA指纹图谱特征研究。结果表明四大商品区的生品牛蒡子DNA指纹图谱一致,制品牛蒡子的DNA指纹图谱与生品的有较大差异。

作为中药制剂的质控指标。用以评价产品质量及稳定性三七药材、提取物及市售主含三七成分的注射液应用Rp—HPLC(DAD)进行指纹图谱研究中,其皂苷类成分均得到很好分离,图谱作为三七药材,提取物及含三七主成分注射液的专属性指纹图谱。醒神滴鼻液、脑醒滴鼻液、脑醒注射液等复方制剂采用GC/MS进行鉴别研究,结果表明单味药材中的挥发性特征成分或主要成分在全方总离子流图中均可检出,以其出峰先后及相对含量为特征。构成了复方制剂的GC/MS指纹图谱。说明GC/MS可应用于中药复方制剂的鉴别研究。指纹图谱中特征成分的相对含量保持稳定更能有效控制制剂产品质量,复方制剂GC/MS指纹特征图谱的建立是提高中药复方制剂质量标准的有效途径之一。六味地黄丸应用薄层扫描法,通过阴阳对照确定每味药材存在,也能控制其质量。

用以评价制剂工艺的合理性三七注射液采用LC/ MS技术测定药材,中间体及针剂成品的指纹图谱,通过实验比较,确定75%乙醇为较适宜的提取溶剂。琼玉膏(由生地黄、党参、茯苓三味药组成以提取液中水溶性提取物量、薄层层析的指纹图谱以及君药生地黄的主要有效成分梓醇(I)的含量作为工艺考察指标,采用不同的煎煮时间。其实验结果显示,提取所得提取液,薄层层析行为无差异。薄层指纹图谱基本一致,而煎煮7h水溶性浸出物含量和(I)的含量均已达最高值。在7h内,煎煮时间越短,水溶性浸出物量和(I)含量则越低。从上述各指标综合考察都说明琼玉膏的原提取工艺是合理的,煎煮7h是必要的。连翘用SD及SFE—cch所提挥发油的化学成分及其含量采用Gc—MS分析进行比较,结果表明后者的提取率高。






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