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二恶英及其类似物Ⅲ食品测定方法

来源:中国食品卫生杂志 作者:吴永宁赵云峰 2004-9-30
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摘要: 食品中PCDD/Fs分析属超痕量(pg-fg)、多组分(同系物、异构体的分离)和复杂前处理技术,对特异性、选择性和灵敏度的要求极高,成为当今食品和环境分析领域的难点。〔1〕超痕量分析是因二恶英在环境样品中水平极低,WHO规定的TDI为1~4pg/kgBW。〔2〕相应要求食品中PCDD/Fs测定方法的检测限以脂肪计低于1pg/g(甚至为fg/g水平......


  MS方法的灵敏度不是由标准溶液的信噪比提供,而是由样品基质条件下的信噪比决定。LRMS在理论上可以达到检测要求的灵敏度,但由于复杂基质和共存的PCBs及其它氯代化合物的干扰,食品中PCDD/Fs低于pg/g水平的分析的灵敏度和其它技术指标都难以达到分析要求。〔4,6,19,20〕为了得到分析食物中TCDDs的准确结果,分辨率在10000以上的HRMS成为唯一选择。因为TCDD的M+离子m/z为319.8963,而干扰物二氯二苯基二氯乙烯的M++4离子为319.9321,需要分辨率为9,000的HRMS。双聚焦磁式扇形HRMS不仅提高了仪器的分辨率,而且提高了信噪比,这意味着化学噪音的降低、灵敏度的提高,〔4〕同时检测多个离子质量的能力较强,进行SIM时m/z值可长时间不发生漂移,进一步改进信噪比,提供极高的灵敏度,最小检出限可达10fg,更适合于PCDD/Fs分析要求,为多数二恶英分析实验室采用。基于HRMS的技术优势,EPA规定的1613方法采用同位素稀释法,利用HRGC-HRMS检测PCDD/Fs。其分析的关键点为:用13C同位素内标与样品前处理同时进行,监测样品制备的回收率、同位素稀释的准确度和GC-MS方法的确认。〔21,22〕采用标准考察异构体的GC分离和MS的定性定量的分析质量控制。严格控制硅胶、硅镁吸附剂、氧化铝、活性炭等的洗提回收。HRMS的分辨率要求在10000以上,保证SIM的灵敏度和稳定性,采用HRGC分离。质量控制措施包括:系统空白、回收试验、线性范围、各化合物的保留值窗口、氯取代的同位素峰簇比值、异构体的GC分离、质谱分辨率、信噪比、盲样核对以及用3个离子定性等。对所有被检测的离子,确定PCDD/Fs的存在必须要求其信噪比大于3:1,且分子的面积比和标准的离子碎片的偏差应在10%以内,由内标物得到的数据与标准物的偏差应在10%以内,标准物与内标的离子谱图应一致。〔4〕由于严格的分析质量保证体系,1613方法已经成为各实验室分析工作的基础。

  串联质谱是另外一种可供选择的方案。在离子源中形成的离子被第一个质量分析器分离,然后选择某些离子进行碰撞裂解,再由第二个质量分析器检测裂解离子。如果第一个质量分析器为扇形HRMS,设定分离PCDD/Fs的M+碎片;第二个质量分析器为四极杆LRMS,分离M+—COCl特征碎片。这样仪器的选择性进一步提高,可不通过GC分离直接进样,快速测定TCDD。〔23〕但这一方法只能测定同系物,不能分离异构体。因此HRGC-MS/MS串联质谱就成为测定17种2,3,7,8-取代PCDD/Fs的要求,而这一仪器与HRGC-HRMS的购买和维护费用相当、灵敏度是其的1/6,HRGC-HRMS就成为首先选择。

  最近美国FDA研究了利用较便宜的四极离子储存时间串联质谱(QISTMS)分析方法。〔9〕采用这一方法可以检测食品中TEQ低于1pg/g水平的2,3,7,8取代的PCDD/Fs(TCDD为0.2pg/g),分析了包括奶、羊脂、蛋、牛肉、鱼和油脂在内的200份物样品。测定污染样品鸡蛋和鲇鱼的结果与HRMS具可比性。FDA正对这一分析方法进一步改进,以期可达HRMS检测限,来替代HRMS进行食品PCDD/Fs日常监督。〔24〕

  1.6 结果报告 测定了17种2,3,7,8-取代的PCDD/Fs含量后,每个同系物异构体的浓度乘以相应的TEF,然后将结果相加。报告的结果就是毒性当量(TEQs)。结果报告时应根据相应的脂肪含量折算成以脂肪计的TEQs。

  2 以Ah受体为基础的生物分析方法

  尽管CAC认为HRGC-HRMS是目前唯一适合的分析方法,但由于所使用仪器价格昂贵,试样需多步分离、净化步骤十分繁琐,这一工作在大多数实验室不能开展。这显然不能适合食品卫生监督和监测工作的日常需要,国际上有些实验室试图建立一种以利用生物传感器为原理的快速检测方法。因为Ah受体是PCDD/Fs发挥毒性作用机制的基础物质,它的被活化程度与PCDD/Fs毒性相一致,而PCDD/Fs活化Ah受体能力与其TEQs有关,目前所建立的生物学筛选方法均据此进行。PCDD/Fs进入细胞浆与Ah受体结合活化后,被Ah受体核转位因子(ARNT)转移到细胞核,活化的核内基因是特异性DNA片段-二恶英响应因子(DRE),启动发挥毒性作用的基因增加其转录,如细胞色素P4501A亚型,激活芳香烃羟化酶(AHH)和9-乙氧基-3-异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD)。〔25~28〕以前已经有实验室用细胞培养通过EROD活性的测定来反应PCDD/Fs激活Ah受体的能力,得到PCDD/Fs的TEQs。〔4,29~32〕为了增加生物学方法的灵敏度,从P4501A1基因5'段分离DRE,并将萤火虫萤光素酶作为报告基因结合到控制转录的DRE上,制备成质粒载体。将这一质粒载体转染H4IIE大鼠肝癌细胞系(含Ah受体传导途径的各个部件),以此构成的CALUX系统萤光素酶诱导活性与PCDD/Fs有关,CALUX相对活性与PCDD/Fs的TEF相一致,所测定的结果就是TEQs。〔33~37〕这一方法已经与HRGC-HRMS化学方法进行对比,结果相当一致。〔37〕然而,采用细胞培养方法仍需要一定条件,同时培养时间多达24h,整个测定多达几天,不能进行快速检验,不适用于食品安全监督检验要求。有必要对Ah受体活化程度进行更直接测定。〔38〕在此基础上进一步改进,以Ah受体、ARNT和DRE为生物传感器的主要部件,测定转化的Ah受体。由于Ah受体与ARNT为1:1结合的同源二聚体,这一同源二聚体可以结合在生物素-亲和素系统的DRE上,采用酶标双抗方法测定ARNT,避免了抗体不能区别Ah受体的难点。由于该方法不再需要细胞内的诱导活化过程,体外活化时间由24h减少到2h,加上ELISA检测,整个分析在1个工作日完成。以Ah受体为生物传感器建立的免疫生物学方法一次可完成多个样品的检测,提取方法相对简单,所得结果就是TEQs,方法完成后可以满足卫生监督的大量筛选需要。


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