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家族性大前庭水管患者的PDS基因型分析

来源:临床耳鼻咽喉科杂志 作者:戴朴等 2010-5-16

摘要: 戴朴 韩东一 曹菊阳 翟所强 康东洋 刘新 袁慧军 张昕 李梅 刘丽贤 冯博 杨伟炎 吴柏林(解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科,美国哈佛大学儿童医院实验医学病理科)临床耳鼻咽喉科杂志2006年2月第20卷第4期近年来国外的多项研究表明大前庭水管综合征和Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)与PDS(S......



戴朴 韩东一 曹菊阳 翟所强 康东洋 刘新 袁慧军 张昕 李梅 刘丽贤 冯博 杨伟炎 吴柏林

(解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科,美国哈佛大学儿童医院实验医学病理科)

 

临床耳鼻咽喉科杂志2006年2月第20卷第4期

 

近年来国外的多项研究表明大前庭水管综合征和Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)与PDS(SLC26A4)基因突变有密切的关系。PDS基因含21个外显子,开放阅读框架2343 bp,编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成,属于离子转运体家族,研究表明其功能主要与碘/氯离子转运有关。本文报道2个大前庭水管综合征家庭,2个家庭子女均患有双侧感音神经性聋,颞骨CT检查均提示患者的双侧前庭水管扩大,针对他们的基因型分析均发现PDS基因的双等位基因突变。

 

1. 对象与方法

 

1.1 研究对象

 

家系1:例1、例2 为同卵双生姐妹,9 岁,北京籍,普通小学就读。均于7 岁时发现听力下降,无明确诱因,听力下降程度有波动,语言交流尚可,发声略含糊。纯音测听提示:4耳均为感音神经性聋。最近一次纯音测听,平均语频听阈:例1 左侧为75.0 dB HL(2年前为65.0 dBHL),右侧为93.7 dBHL (2 年前为93. 7 dBHL);例2 左侧为86.2 dBHL(2年前为57. 5 dBHL),右侧为65.0 dBHL(2年前为46.2 dBHL)。颞骨CT 检查:例1、例2双侧前庭后方均见三角型骨质缺损,影像诊断均为大前庭水管(图1);甲状腺B 超和甲状腺功能检查未见异常。父母听力正常,非近亲结婚,双方家族内无其他耳聋患者。

 

双侧前庭水管扩大

 

图1  例1 的颞骨CT图像

 

家系2:例3、4为兄妹,分别为24 岁和21 岁,内蒙古籍,例3大学已毕业,例4于2005年被某地方农业大学录取,均于3岁时发现听力下降。例3发病可能与应用链霉素和外伤有关,例4 无明显诱因。听力下降程度均有波动,进行性加重。纯音测听提示4 耳均为感音性聋。语频纯音平均听阈:例3 左侧为73.7 dBHL ,右侧为83.7 dB HL;例4 左侧为73.7 dBHL,右侧为70.0 dB HL。例3甲状腺B超提示小腺瘤,甲状腺功能检查未见异常;例4未查甲状腺B 超和甲状腺功能。父母听力正常,非近亲结婚,双方家族内无其他耳聋患者。家长或本人均签署耳聋基因检测知情同意书。

 

另选无感音神经性聋病史者50 例为对照组。

 

1.2 DNA 提取方法

 

采集受检者外周血3 ml,应用试剂盒提取DNA(上海华舜生物工程有限公司),提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行。取适量提取的DNA 用紫外分光光度计进行定量和纯度检测,其余保存于-70℃备用。

 

1.3 PDS 基因分析方法

 

扩增PDS 开放阅读框架中的所有20 个外显子,其中7 、8 外显子同在一个扩增子内,11 、12 外显子同在一个扩增子内,共扩增18 个片段以覆盖PDS全部cDNA序列及每个外显子前后的剪切区序列。对照组与待测患者的每个外显子的PCR 产物各10μl混合,于95 ℃变性5 min后以每分钟降低温度1℃的速度进行复性,直至20℃。复性产物置于3500 HT DHPLC Wave system进样区自动进样,每次进样5μl,不同外显子采用1~3个不同柱温(52. 5~66. 8℃)以实现最佳分离效果。

 

结果判定:若待测标本与对照组标本的混合物的过柱波形与对照组的过柱波形完全一致,为正常;待测标本与对照组标本混合物的过柱波形与对照组相比有前移、后移或有明显的波形畸变,特别是出现2~4个波峰,判定为待测标本的扩增片段内可能存在序列变异,将此待测标本的扩增子进行全自动序列分析。全自动序列分析步骤参见ABI公司操作手册。

 

2. 结果

 

根据大前庭水管散发病例的基因诊断经验,首先进行例1~4 的7 + 8 外显子的直接序列分析,测序结果表明例1 、例2 均为PDS IVS722 A2G 纯合突变,例1 、2 的父母亲序列分析结果均为PDS IVS722 A2G杂合突变(图2),家系1 成员的表型和基因型共分离,父母均为大前庭水管致病基因携带者。

 

图2  家系1 全部个体的PDS IVS722 A2G序列图

 

例4 PDS 1~20外显子扩增产物与对照组的相应扩增产物混合液的DHPLC 过柱波形均与对照组各相应外显子扩增产物相比较,其中例4 的第10外显子的过柱波形与对照组明显不同,对照组仅见1 个波峰,而例4 可见4 个分离的波形(图3)。

 

进一步序列分析表明,例3 和例4 均携带1199 insT和T410M(1229 C-T)复合突变;例3、例4的父母亲序列分析结果表明父亲携带T410M(1229 C-T)杂合突变,母亲携带1199 insT 突变(图4)。家系2成员的表型亦与基因型共分离,父母均为大前庭水管致病基因携带者。

 

A :对照组;B :例4

 

图3  例4 PDS Exon10 异常DHPLC波形

 

图4  家系2 患者PDS Exon 10 复合突变的测序图

 

对照组50例的基因检测发现1 例为PDS IVS7-2 A-G杂合突变携带者,此例45岁,北京籍,无自觉听力障碍,测听显示双侧高频听力轻度下降;DHPLC 筛查均未发现第10 外显子扩增产物有异常波形。

 

3. 讨论

 

大前庭水管综合征是儿童、青少年中较为常见的一种内耳疾病,可表现为先天性或后天性感音神经性聋。Valvassori 和Clemis 于1978 年报告,在3700例听觉或前庭功能障碍患者的颞骨多轨迹断层摄影中,有50 例(1. 5%)前庭水管扩大,并将临床上伴有感音神经性听力损失等症状者称之为“大前庭水管综合征”。1985年Emmett报告,在2500例颞骨断层摄影中发现大前庭水管26 例,其中5例为单侧畸形,患侧耳全部呈现感音神经性聋,而对侧听力皆正常。显示大前庭水管有较高的发生率。

 

在西方,Pendred综合征是一种常染色体隐性遗传疾病,1996年Pendred综合征基因被定位到染色体7q31,1997年PDS基因被克隆,并发现PDS基因突变导致Pendred综合征和孤立的大前庭水管综合征的发病(3~5)。

 

本研究采用DHPLC 配合测序方法进行分析,分析步骤先进行热点区域的序列分析,若无热点突变,以DHPLC 方法进行PDS 基因的全基因筛查,发现异常波形后再行序列分析,保证针对PDS 的基因诊断可以快速、有效、经济地进行,PDS 基因分析结果表明4 例大前庭水管患者均具有双等位基因突变,2 个家庭间的突变形式不同,同一个家庭中

 

不同患者的突变形式完全相同,2 个家庭中的父母均发现相应的单一杂合PDS 基因突变,符合其携带者身份。

 

在家系1 中发现的PDS IVS7-2 A-G 突变是PDS 基因第7 内含子距第8 外显子起始2 个碱基位置的腺嘌呤至鸟嘌呤的置换,这一位置是重要的剪切部位,此突变可能造成第8 外显子序列转录和翻译异常而产生异常的Pendrin 蛋白。1999 年在一个土耳其近亲家庭内发现的1143-2A-G突变(从发表的序列图和作者描述的位置推算实际为919-2A-G,可能为作者核苷酸位置计算不同或错误)与IVS 7-2 A-G为同一位置突变,其中6 例耳聋患者具有114322A2G 纯合突变,而家族内单一的1143-2A-G杂合突变携带者不发病,证明此突变是耳聋的致病基因[6]。在家系2 中发现的T410M 突变是一个已知突变[7],此突变位于第10 外显子,由1229 位点的C变为T,同时在此家庭检测到的复合突变1199insT 亦位于第10 外显子,这是一个未报道过的新突变,将导致Pendrin 蛋白在第400 位即发生变化,蛋白长度由780 氨基酸被截短至467氨基酸。2 个家系的3 种突变均来自他们的父母,不支持3 种突变类型是新生突变的可能性。

 

在对照组的50 例中发现1 例携带PDS IVS7-2A-G突变,即100 条染色体中发现一条染色体含有PDS IVS7-2 A-G 突变,一定程度上反映PDS IVS7-2 A-G突变在我国正常人群中有较高的携带率,这也是国人大前庭水管发病率较高的遗传学基础。

 

在我国,罕见有典型的Pendred 综合征的报道,但是大前庭水管综合征的发病比例较高[8]。关于大前庭水管综合征的分子病因未见报道,本研究选用的病例均具有一个家庭2 个子女患病的特点,首先表现出一定的遗传特质,所有患者的特点均具有一定的残余听力,甲状腺功能无异常,具有较好的语言交流能力和学习能力,能够在正常学校进行学习或完成学业。患者的临床特点与西方Pendred综合征患者的重度先天性聋、甲状腺功能异常和甲状腺肿有一定的区别,表明PDS 基因突变引起的表型特征亦具有人种差异。

 

本研究在2 个大前庭水管家系均发现PDS 基因的纯合突变和复合突变,从遗传学角度证实此病为常染色体隐性遗传疾病,PDS 基因分析和诊断方法的建立将有利于此病的准确诊断和早期诊断,通过正确的指导保证患者残余听力的维持,并可通过优生、优育手段预防此类新生儿的再出生。

 

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