当前位置:首页 > 合作平台 > 医学论文 > 外科论文 > 耳鼻喉科学 > 1190例非综合征性耳聋患者GJB2基因突变分析

1190例非综合征性耳聋患者GJB2基因突变分析

来源:中华医学杂志 作者:于飞 韩东一 戴朴等 2010-5-16

摘要: 于飞 韩东一 戴朴等 (解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科)中华医学杂志2007年10月30日第87卷第40期耳聋是导致言语交流障碍最常见的疾病。据各国统计,有1/2000-1/1000的儿童出生时为极重度耳聋。同时,一半以上的儿童期耳聋为遗传因素所致。GJB2基因突变与遗传性非综合征性耳聋(NSHI)密切相关。...



于飞 韩东一 戴朴等

(解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科)

 

中华医学杂志2007年10月30日第87卷第40期

 

耳聋是导致言语交流障碍最常见的疾病。据各国统计,有1/2000-1/1000的儿童出生时为极重度耳聋;同时,一半以上的儿童期耳聋为遗传因素所致。GJB2基因突变与遗传性非综合征性耳聋(NSHI)密切相关。为此,我们对17省市聋哑学校的1190例NSHI患者进行GJB2基因的全序列检测,以了解中国NSHI患儿的GJB2基因突变特点。为我国GJB2基因突变图谱的绘制提供一定的基础。

 

对象与方法

 

临床资料

 

NSHI患者1190例,分别来自北京、河北、黑龙江、吉林、内蒙古、山西、河南、湖北、陕西、甘肃、宁夏、青海、安徽、江苏、上海、福建、广东、广西等地区聋哑学校;年龄1-26岁,平均13.35岁;经病史询问、全身及耳鼻咽喉专科检查、纯音测听或脑干诱发电位检查等确定为重度或极重度非综合征型双侧感音神经性耳聋。排除:(1)与国外种族联姻家族史者;(2)外耳、中耳畸形;可能导致传导性耳聋病史,如有急慢性中耳炎的病史;有中耳或外耳手术史;声导抗测试结果异常;(3)有其他明确的导致听力下降的原因(如:细菌性脑膜炎、迷路炎、累及耳蜗的颞骨骨折等);伴有全身疾病者(如:心脏病、糖尿病等);(4)影响听力检测结果的疾病(如:智力障碍者);(5)诊断为进行性耳聋的患者(如:自身免疫性内耳病、梅毒性内耳疾病等);(6)已经明确为综合征型耳聋患者(如:waardenburg综合征,Usher综合征等)。对照组为301例听力正常且无全身系统疾病儿童。经本院伦理委员会批准,所有家长均签署知情同意书。

 

实验方法

 

DNA制备

 

试剂盒提取DNA(上海华舜生物工程有限公司),取适量用紫外分光光度计(Beckman Coulter DU800)进行定量和纯度检测,其余保存于-70℃冰箱(SANYO)备用。(2)引物计与合成:GJB2基因的编码区位于第二外显子,设计引物为5’TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA 3’/5’GGCCTACAGGGGTTTCAAAT3’,扩增片段944bp,扩增产物覆盖全部编码区。(3)聚合酶链反应(PCR)扩增:通过PCR反应扩增DNA编码区。在50μl的反应体系中加入100ng的基因组DNA,10倍缓冲液(含MgCl:15 mmol/L)缓冲液5μl,10倍脱氧核苷三磷酸5μl,上下游引物(浓度2μmol/L)各2.5μl,加DNA聚合酶(法特捷,2.5 U/μl)1μl。PCR反应在(美国生物公司ABI 2700)热循环仪上完成,反应条件为94℃ 5min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,30个循环;72℃延伸5min。PCR产物4℃保存。取4μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0.5μg/ml)检测产物,扩增片段944bp。(4)PCR产物直接测序:测序引物与PCR扩增引物相同,对PCR产物进行酒精沉淀法纯化、Bigdye测序反应PCR(正反双向)、甲酰胺变性,变性产物应用美国ABI 3100一Avant Genetic Analyzer测序仪进行测序,测序结果使用Genetool Lite软件包与来自NCBI网站的人类GJB2基因标准序列(ACCESSION:AY280971,VERSION:Y280971.1,GI:33391196)(http:∥www.Ncbi.nlm.nih.gov/~nucleotde&val=33391196)进行比对,发现可疑的突变位点后读取测序结果的峰图文件,进行确认或排除。测序反应PCR条件:在10μl的反应体系中加人5 ng的PCR纯化产物,单向引物(浓度2 pmol/μl)1.5μl,2.5×Bigdye 0.5μl,5 x缓冲液1.5μl。PCR反应在(美国生物公司ABI 3700)热循环仪上完成,反应条件为96℃ 1 min;94℃ 10 s,50℃ 5 s,60℃ 4min,25个循环。

 

统计学处理

 

用SPSS 11.5软件进行统计学分析,组间比较用χ2检验,P<0.05即认为差异有统计学意义。

 

结果

 

患者的病理性突变

 

在1190例NSHI患者中,共检测到16种明确的病理性突变(表1、图1)。

 

表1 检测到的病理性突变

 

NT:氨基端,M:跨膜区,EC:细胞外区,CL:细胞内环,CT:羧基端

 

图1 NSHI患者病理性突变在GJB2基因功能阈的位置及数目。红色三角所指为GJB2基因突变位点在蛋白结构阈的位置,直方图上所标数值为相对等位基因数目

 

病理性突变携带率

 

在NSHI患者中。共检出250例携带明确的GJB2基因突变,占2l .01%(250/1190),其中纯合突变98例、复合杂台突变92例,单杂合突变60例。最常见的突变235delC、299delAT和176del16bp,其中有98%(245例)携带3种常见突变中的至少1个突变,占所有检测人数的20.59%(245/1190);仅有2%(5例)携带其他位点的突变。

 

常见病理性突变检出率

 

1190例患者中,GJB2基因最常见的突变为235delC,其中纯合突变93例、杂合突变129例,共计222例,检出率为18.66%,占携带明确的病理性突变患者的88.80%(222/250);其次为299-300delAT,纯合3例、杂合59例,共计62例,检出率为5.2l%,占携带明确的病理性突变患者的24.80%(62/250);176del16bp纯合1例、杂合18例,共计19例,检出率为1.60%,占携带明确的病理性突变患者的7.60%(19/250)。由NSHI患者和对照组所携带的不同序列改变人数可以看出,两组间235delC(χ2=58.465,P<0.01),299-300delAT(χ2=10.229,P<0.01)和176del16bp(患者组1.60%,对照组0)的差异有统计学意义。

 

常见病理性突变等位基因检出率

 

1190例NSHI患者的等位基因总数2380个,检测到病理性突变等位基因428个,占17.98%(428/2380);235delC在突变位点中的等位基因检出率最高,为13.24%(315/2380),占已检出的突变等位基因比例为73.60%(315/428);其次为299-300delAT,检出率为2.73%(65/2380),占已检出的突变等位基因比例为15.19%(65/428);176del16bp检出率为0.84%(20/2380),占已检出的突变等位基因比例为4.67%(20/428)。

 

不同地区病理性突变检出率特点

 

在检测中发现,多数地区GJB2基因病理性突变等位基因的检出率有共同特点:235delC等位基因的检出率最高,其次为299-300delAT、176del16bp,其他病理性突变等位基因的检出率较低,仅青海的299-300delAT的检出率较高(图2)。

 

图2 地区的不同病理性突变等位基因检出率 每个直方柱表示该地区所有病理性突变的等位基因检出率,各直方柱中的不同颜色表示该地区不同突变的等位基因检出率.检出率=病理性突变等位基因数/该地区等位基因总数

 

患者组与对照组统计学处理

 

在301例正常对照者中,等位基因总数602个;235delC和299-300delAT的等位基因频率均为0.5%(3/602),未检测到176del16bp的携带者。NSHI患者与正常对照组之间,235delC等位基因频率(13.24%和0.50%)有统计学意义(χ2=81.818,P<0.01);299-300delAT(2.73%和0.50%)有统计学意义(χ2=10.749,P<0.01);35delG、E47X、512insAACG在对照组中也有携带,但出现的频率少,且176del16bp等在对照组中未发现,故未进行统计学处理(表2)。

 

表2 NSHI患者与正常对照携带相同等位基因的不同比例

 

16种病理性突变的测序图谱

 

测序图谱见图3(略),图中仅列出相应突变的杂合突变图谱。

 

讨论

 

现代遗传学认为,基因是DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称,是具有遗传效应的DNA分子片段。基因位于染色体上。并在染色体上呈线性排列,不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代,还可以使遗传信息得到表达,使遗传信息以一定的方式反映到蛋白质的分子结构上,从而使后代表现出与亲代相似的性状。基因检测是通过探测基因的存在,分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常,来诊断疾病的一种方法。对于耳聋基因的研究可以确定其遗传方式,并根据其遗传方式进行早期诊断和早期干预、早期治疗及准确咨询。

 

GJB2基因1993年被克隆,定位于13q11-12,DNA全长4804 bp,编码区为678 bp。由于蛋白的编码序列仅存在于一个外显子,因此很容易通过PCR反应结合测序进行分析。1997年人们发现缝隙连接蛋白(connexin26,Cx26)基因突变与遗传性非综合征耳聋密切相关,因而越来越多的学者致力于该基因的研究。免疫组化证实,内耳非感觉上皮细胞和组织连接细胞表达GJB2基因编码的Cx26蛋白,在声音传导过程中,Cx26蛋白对K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起调控作用,GJB2基因突变后,K+进入内淋巴液的循环受影响,导致感音神经性聋。为了解我国大多数NSHI患者特有的GJB2基因突变方式、绘制我国NSHI患者的GJB2全序列突变图谱,也为了配合产前诊断,预防聋儿的出生,我们先期对17省聋哑学校1190例患者进行了GJB2基因的全序列测定,分析其突变特点,并对301例听力正常儿童进行对照检测。

 

在本分析中共检测到病理性突变16种(图3)。其中W3X、155delTCTG、313del14bp、388del10bp、512insAACG为首次发现的病理性序列改变。W3X(9G>A)使位于第9位的碱基G突变为A,导致GJB2基因的终止密码子提前至3号,多肽链的合成提前终止,翻译的多肽长度缩短、仅有2个氢基酸,明显少于野生型蛋白的226个氨基酸,其多肽的各区全部缺失,产生完全无功能的缝隙连接蛋白。155delTCTG、313del14bp、388del10bp、512insAACG等突变的类型与235delC相类似,由于与缝隙连接孔形成或通道的通透性有关,因而以上的缺失或插入突变使遗传密码发生框移突变,导致多肽的各区部分或全部缺失,从而产生无功能的缝隙连接蛋白。突变型的蛋白可能丧失了对缝隙连接通道pH值的调控,降低了缝隙连接的通透性,从而导致听力的下降。其中512insAACG突变仅影响第四跨膜区的形成,对蛋白功能的影响与其他病理性突变相比较小,但纯台突变及复合杂合突变患者的耳聋程度仍为重度或极重度。上述5种序列由于均位于基因的高度保守区,碱基的缺失使终止密码子提前而使翻译的氨基酸缩短,导致缝隙连接蛋白功能减退,因此这5种突变序列的出现可以肯定为导致耳聋的原因。

 

本研究中,在检出的纯合突变98例中最常见为235dele纯合突变。GJB2基因中有复合突变导致耳聋的报道,本研究中检出复合杂合突变92例,且大多数突变都是与235delC、299delAT或176del16bp复合存在的。由于两条等位基因同时存在突变位点时,将不能产生正常的缝隙连接蛋白,因此会导致重度或极重度感音感音性耳聋的发生。

 

在301例正常对照者中,3例携带235delC、3例携带299-300delAT,等位基因频率均为0.5%(3/602),未检测到176del16bp的携带者。同时,无纯合病理性突变或复合杂合突变者存在。

 

由NSHI患者与对照组所携带的不同序列改变人数及等位基因可以看出,两组间235delC、299-300delAT差异有统计学意义(均P<0.01),176del16bp在对照组中未发现。可以证明235delC是中国NSHl人群中GJB2基因最常见的突变方式,其次为299-300delAT、176del16 bp,其他病理性突变等位基因的携带率较低。因此,我们在初期对GJB2基因的筛查方向是完全正确的,在对中国人群NSHI患者的分子学病因进行诊断时,重点检测的突变位点应为235delC、299-300delAT、176del16bp。GJB2基因在NSHI患者中的高突变率提示该基因突变分析可作为对NSHI患者的常规分子遗传学检测手段,可用于产前诊断以降低耳聋的发病率。对预防耳聋家庭再次生育聋儿可以起到明确的指导作用。

 

相关专题:爱要让你听见——关注耳聋基因筛查

 

 

 


医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《1190例非综合征性耳聋患者GJB2基因突变分析》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有 苏ICP备12067730号-1
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: