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基因治疗技术与组织修复的基因治疗

来源:中华整形烧伤外科杂志 作者:蒋礼先付小兵 2004-10-14
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摘要: 基因治疗是现代分子生物学技术发展的产物,自美国第一例基因治疗以来,发展迅速,得到了社会和科学家的重视,不但在一些遗传性疾病如血友病、白化病等方面引起了重视,也在一些非遗传性疾病如癌症、获得性免疫缺陷综合征的治疗等方面得到了应用[1]。研究发现[2],部分伤口中某些生长因子半衰期较短,以及一些酶活力增......


  基因治疗是现代分子生物学技术发展的产物,自美国第一例基因治疗以来,发展迅速,得到了社会和科学家的重视,不但在一些遗传性疾病如血友病、白化病等方面引起了重视,也在一些非遗传性疾病如癌症、获得性免疫缺陷综合征的治疗等方面得到了应用[1]。组织修复有其自身的特点,创面经过炎症期、肉芽期等几个时期逐渐愈合。研究发现[2],部分伤口中某些生长因子半衰期较短,以及一些酶活力增高,致使生长因子浓度相对降低,伤口迁延不愈,形成慢性难愈合创面,而另一些创面由于生长因子浓度的持续增高,细胞增生过度,则形成瘢痕或瘢痕疙瘩,因此修复质量是创伤治疗的核心。自基因治疗技术发展以来,为创伤的临床治疗提供了新的思路。

  1 基因治疗技术

  一般而言,从策略上考虑,进行基因治疗有两种方法,一是体内法,即将载有目的基因的载体直接注入受损创面,从而将目的基因整合到基因组上,提高生长因子等促创面愈合因子的分泌。然而该方法具有一些明显的不足,首先是被转染的细胞特异性不高,一些非特异性细胞也将被整合上目的基因,导致生长因子表达的紊乱,虽然可能促使伤口愈合,但同时也将影响组织的其他生理功能;其次,如病毒转染,虽然目前尚没有因基因治疗诱发病毒感染,导致癌化的报道,但存在潜在的危险性。另一种是体外法,可克服体内法的不足,将待转染的细胞从机体中分离出来,在体外培养,扩大细胞数,然后再运用多种转基因方法将目的基因导入细胞,经筛选,将载有目的基因的细胞回输入机体,从而在机体中分泌该种生长因子,促进创面愈合。但这两种策略均离不开一些具体的基因转导技术。

  1.1 非病毒转导技术

  1.1.1 脂质体转导技术:脂质体包裹的DNA转导技术有赖于DNA、脂质体的离子特性以及细胞膜表面的负电荷。具体过程为,脂质经氯仿抽提,蒸干,重新溶于水,经超声处理等一系列过程[3]。脂质体与DNA非共价结合成复合体,以脂质体—DNA复合体的形式吸附在靶细胞表面,将DNA导入胞浆。然而该方法DNA整合体转导的稳定性较低,与磷酸钙转导率近似。

  脂质体转导可以用于各种组织细胞,其主要优点是对基因片段大小的限制较少,而且转导细胞相对无害,重复性好。然而其缺点是基因转入细胞,整合到细胞染色体上形成稳定性的基因组较低,并且靶细胞的组织特异性差,不利于特定组织细胞的基因转导。

  1.1.2 基因枪技术:该技术的要点是将目的基因制成带电颗粒,在高压电泳的作用下,直接穿透细胞膜进入细胞,在细胞自身的生理机制下,整合到宿主染色体上,形成稳定的基因表达。有趣的是,该技术并非首先用于动物细胞的基因转导,而是最早应用于植物优良品种的培育。近年研究发现,它也可以应用于哺乳动物。有文献报道[4],基因枪技术可以应用于多种组织细胞,不受动物种属和器官特异性的限制,如皮肤、肝脏、胰腺、肾脏和肌肉等均有成功的报道,而且能够较长时间的测定到转导组织中目的基因的表达。然而总的来说,转导基因的表达是短暂的,长效表达的基因率较低[5],但其优点也比较明显,如应用广泛,可携带的DNA片断较大,目的基因多,可用于不同基因间共表达,从而有利于探讨不同基因间的相互关系。

  1.2 病毒转染技术

  1.2.1 重组逆转录病毒:逆转录病毒是一个8kb单链RNA病毒,目前常用的是鼠逆转录病毒[6],包含三个重要的病毒基因:编码逆转录酶系统的pol基因,编码外壳蛋白的 env基因以及与病毒蛋白组装有关的gag基因。这三种基因均可以被目的基因所取代,形成重组逆转录病毒载体。然由于该载体没能组成具有感染力的病毒,并不能就此感染靶细胞,需经包装细胞系提供组成病毒必需的蛋白质,组装成具有感染活性的载体病毒,才能用于基因转染,其浓度大约需要10-6~10-7PFu/ml。包装的病毒与靶细胞共同孵育,与细胞表面的受体相结合,将DNA注入胞内,而蛋白质外壳留在胞外,进入细胞的DNA在逆转录酶等酶的作用下,整合到宿主基因组中[7]。该方法的优点是有相对较高的DNA整合率,但可转染的DNA片断较小,而且经包装后可用于转染的病毒浓度较低,限制了它的应用。

  1.2.2 重组腺病毒技术:腺病毒是一个35kb的双链DNA病毒[8],大多数重组腺病毒载体是腺病毒Ⅴ型及Ⅱ型突变体。该病毒基因由几个早期(E1~E4)和晚期基因(L1~L5)转录区域组成,其转录区依赖复制前后的调控基因的表达。大多数腺病毒载体具有一个可去除的E1区,该区可被目的基因所插入,如要插入较大目的基因,E3区也可去除,一般来说,重组腺病毒通过包装细胞株293由目的基因与腺病毒E1区同源重组构成。与重组逆转录病毒相比,得到的有效重组病毒的滴度较高,而且能够转染分化的细胞,然而其缺陷是具有较大的毒性,易引起机体的免疫反应,从而影响转染效果[9]。

  2 基因治疗在皮肤软组织修复中的应用

  由于创伤可发生在多种组织细胞,每种组织器官有其自身的特点,因此临床基因治疗是一个复杂的生物学过程,战略上一般需要考虑靶器官的特点、目的基因及技术方法的选择等事项。根据皮肤软组织创伤修复的特点,基因治疗时有不同的侧重点。

  2.1 促进细胞活性 组织损伤后,需要尽快填补缺损创面,促进细胞分裂增殖,近年研究发现,一些生长因子如FGF、TGF等细胞因子能促进细胞从细胞间期进入分裂期,因此其基因是基因治疗的首选对象。Eming SA等近年报道[10],在软组织损伤中,体外用逆转录病毒技术将PDGF转染角化细胞,再将该细胞移植于去胸腺小鼠创面,病理检查发现,愈合创面皮肤较对照明显增厚,皮下细胞增生,血管含量丰富,纤维连接蛋白沉积增加。如转染IGF[11]除上述表现外,转染的角化细胞分裂增生,迅速覆盖创面,加速伤口愈合。Andree[4]等证实,转染表皮生长因子EGF,受损动物部分皮肤角化细胞分裂增生,向创面中心迁移速度提高,表皮化加剧,伤口愈合时间缩短。Benn[12]等在运用基因枪技术,将TGFβ转染实验动物,


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