胆汁成核效应蛋白的研究进展

　　一、促成核蛋白体系的组成

　　1.非力豆球蛋白A(ConA)结合蛋白：组蛋白质因无甘露糖基与ConA不能结合，且易受蛋白水解酶链霉蛋白酶(pronase)作用而致活性丧失。胆囊粘膜分泌的粘蛋白是文献最早报道的非ConA结合促成核蛋白〔1〕，模拟胆汁体系中结晶生长实验证实粘蛋白不仅具有促成核作用，而且能抑制胆固醇结晶的形成〔2〕。Groen等〔3〕在T管胆汁中发现另外分子量约为30000的非ConA结合蛋白，对热稳定，37℃孵育24 h促成核活性几乎不受影响。因与抑成核蛋白共存于非ConA结合部分，分离纯化较困难，其理化性质有待进一步研究。

　　2.ConA结合蛋白：(1)免疫球蛋白(Ig)：胆汁中ConA结合部分IgA，IgG及IgM的浓度分别为(171±85)μg/ml，(63±49) μg/ml及(53±38) μg/ml〔4〕。在模拟胆汁体系中Ig明显具促成核作用，其促成核活性强弱依次为IgM＞IgA＞IgG。但用相应的特异性抗体免疫吸附去除Ig，ConA结合蛋白总促成核活性丢失不到10%，推测ConA结合蛋白中尚有其他促成核因子，胆汁中绝大部分IgA和IgM是以非ConA结合形成存在的〔4，5〕。(2)α-酸性糖蛋白(AAG)：Abei等发现相对分子质量(Mr)42000糖蛋白不仅存在于胆石症病人，而且也存在于正常人群，氨基酸序列分析及特异性免疫结合反应表明胆汁中Mr42000成核活性蛋白是α-酸性糖蛋白。ELISA法测定多发胆固醇结石病人胆汁中AAG绝对浓度为(59±61)μg/ml，比非胆石症组高出3～5倍，但在单发结石组未发现AAG明显升高〔6〕。理化性质研究示该蛋白质等电点呈酸性(pI＜4.1)，可能与含有大量唾液酸有关，脱糖基后多肽骨架Mr为26000，氨基酸组成分析示大部Gln，Asp和Leu〔7〕。成核活性实验研究发现胆汁中AAG浓度与成核时间成负相关(P＜0.05)，用鼠抗人AAG抗体免疫吸附ConA结合部分中AAG，总ConA蛋白促成核活性约减少1/3，表明AAG是ConA结合蛋白中强促成核活性因子〔5，8〕。(3)低密度颗粒(LDP)：将胆囊胆汁和T管胆汁经ConA-Sepharose柱过筛预处理后，洗脱液以KBr密度梯度超速离心，发现LDP位于离心条带的低密度区(1.08)。成分研究示主要由胆固醇、游离脂肪酸、磷脂及少量蛋白质组成。该蛋白质Mr约85000，SDS-PAGE电涤带弥散，提示其具很强的疏水性。由于N端封闭，未能进行氨基酸序列分析鉴定其性质和结构。负染和冰冻蚀刻电镜示LDP无双层或板层结构，表明LDP不是强促成核活性的胆汁泡。成核动力学实验提示LDP主要参与胆固醇成核过程，而对结晶生长阶段作用不大；脱去脂类后该颗粒活性丧失，但其成核活性不受链霉蛋白酶消化降解的影响〔9〕。(4)氨基肽N(APN)：Groen等〔10〕在胆固醇结石病人胆囊胆汁中分离出Mr130000糖蛋白，具有明显促成核作用。80℃加热30 min促成核活性全部丧失，将糖苷酶与其混匀孵育水解糖基后促成核活性亦随之丢失，表明Mr130000糖蛋白是热不稳定蛋白，其中糖基参与调节其促成核作用。随后Zijlstra等〔11〕和Offner等〔12〕证实了肝胆汁和胆囊胆汁中具促成核活性的Mr130000糖蛋白是APN。尽管胆汁中血浆铜蓝蛋白Mr亦为130000，但该蛋白质无促成核活性，氨基酸序列分析基本上予以排除。进一步研究胆囊粘膜匀浆和白胆汁，两者均未发现APN，提示APN来源于肝脏分泌抑或胆管上皮。(5)α1-抗糜/胰蛋白酶(ACT/ATR)：两者均属急性期反应蛋白，Mr分别为60000和50000。存在于胆固醇结石病人T管胆汁中的ATR和ACT氨基酸组成结构与文献报道的血浆中成分不全一致，其N端已水解16氨基酸。ACT与ATR的成核活性不受链霉蛋白酶影响，减法实验表明ACT是ConA结合蛋白重要的促成核部分，将ACT加入模拟胆汁体系亦能明显促进胆固醇结晶成核和生长作用；但ATR未见类似现象〔11〕。(6)泡蛋白：胆汁泡是肝脏分泌过饱和胆固醇的主要载体形式〔13〕，泡中含有胆固醇、磷脂及少量蛋白质，三者各占40%、58.7%和＜1%。泡的聚集和融合是胆固醇成核的关键步骤，泡相蛋白是此过程的始动因素。Miquel等〔14〕利用垂直转头VTi-50超速离心技术结合ConA亲和层析分离出胆汁泡，SDS-PAGE电泳示泡相蛋白群为200×103、130×103、114×103、66×103、60×103及52×103糖蛋白。除52×103糖蛋白外，余均为疏水性蛋白质。理化性质鉴定130×103、114×103、86×103及(62～67)×103疏水性蛋白质分别为IgA，IgG，IgM和白蛋白〔15〕。1998年，国内马保金等〔16〕又在T管胆汁中分离纯化出Mr33500泡蛋白，成核活性强达0.310，是迄今发现活性最强的成核效应蛋白。HRP-ConA染色借助扫描电镜证实泡蛋白参与泡的聚集和融合、增加泡相胆固醇饱和度，有利于胆固醇结晶的析出〔17〕。

　　二、抑成核蛋白体系的组成

　　1.Mr 120000糖蛋白：Ohya等〔18〕利用凝胶过滤层析法在胆固醇结石胆囊胆汁中分离出Mr120000糖蛋白，浓度约为0.47 μg/ml，仅占胆汁总蛋白的0.02%。尽管量微，却有很强的抑成核作用，成核活性(NTm/NTc)高达1.61。理化性质研究提示该蛋白质由等电点均为6.6的Mr58000和Mr 63000两个亚基组成，一级结构分析其主要含亲水性的Gln，Gly，Ser及Asp等氨基酸。水解脱去与肽链相连的糖基后，Mr120000糖蛋白抑成核活性随之丧失，提示糖基在成核效应过程中起重要作用。Mr120000糖蛋白的来源及理化性质仍有待继续研究。