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核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展

来源:论文汇编 作者:自动采集 2005-1-1
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摘要: 近10余年来现代分子生物学的迅猛发展,为临床实验室诊断提供了较为可靠的核酸检测方法。经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术已广泛应用于结核病的诊断。然而,由于污染问题严重,扩增抑制物的存在,试剂盒缺乏规范化、标准化,加之技术、条件、质控等方面因素影响,其敏感性、特异性差异颇大,人们对其可信度、可靠性产生了怀......



  近10余年来现代分子生物学的迅猛发展,为临床实验室诊断提供了较为可靠的核酸检测方法。经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术已广泛应用于结核病的诊断;然而,由于污染问题严重,扩增抑制物的存在,试剂盒缺乏规范化、标准化,加之技术、条件、质控等方面因素影响,其敏感性、特异性差异颇大,人们对其可信度、可靠性产生了怀疑,给临床医生诊断结核病带来了一定的困惑。为此,国外学者开发出具有高度敏感性、特异性、标准化、商品化的PCR扩增试剂盒;继PCR之后,又发展了几种新的核酸体外扩增技术。现就其在结核病诊断方面的应用与进展作一介绍,供广大同道借鉴。

  一、PCR为基础扩增反应即Roche Amplicor结核分支杆菌PCR试验(Amplicor pCR)

  Amplicor PCR系应用生物素标记位于结核分支杆菌16S rRNA基因中高度保守区域种特异性引物扩增结核分支杆菌复合群DNA中584 bp序列;生物素标记的扩增子(amplicon)与种特异性DNA探针进行杂交后,应用标准酶联免疫技术进行比色鉴定,结果判断以450 nm波长时吸光度(A450)>0.350为阳性标准[1~3]。Amplicor pCR是由瑞士Roche公司开发研制的标准化、商品化试剂盒,该试剂盒有三个不同的小盒:标本处理盒、扩增盒和鉴定盒。为防止交叉污染,厂商推荐试剂制备、标本处理、扩增与鉴定应三室分开,此外,应用尿嘧啶-N-糖基化酶控制扩增子携带污染。研究表明,Amplicor pCR可检出少至2~10个结核分支杆菌中DNA。与培养法相比,Amplicor pCR检测临床标本中结核分支杆菌DNA的敏感性为76.7%~97.8%,特异性达97.7%~99.3%,阳性预计值(PPV)66%~93%,阴性预计值(NPV)98%~98.6%[2~4,6]。若参考临床综合诊断,其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为66.7%~85.4%、99.6%~100%、91.7%~100%、96.8%~98.6%,该方法至少与培养法一样敏感[1,4~6]。对于涂阳标本,Amplicor pCR敏感性(97.6%~98%)显著高于涂阴标本(40%~53%)[4,6]。该方法还可对涂阳标本应用种特异性探针对结核分支杆菌和非结核分支杆菌(MOTT)早期进行菌种鉴定[2,4]。Amplicor pCR整个过程仅需7小时左右,用于检测BACTEC培养基中结核分支杆菌较核酸探针杂交试验提前4天以上[4]。法国学者Carpentier等[5]对Amplicor pCR进行多中心研究,结果显示,其检测肺外标本(尿、胸腹液、脑脊液等)、涂阳标本、涂阴标本及培阳标本的敏感性分别为83%、94.5%、74%、95%,特异性达98%。Amplicor pCR不仅具有高度敏感性、特异性和可重复性,而且操作简单,无需昂贵设备,无放射性污染问题;然而,其灵敏度较经典PCR稍低,可能系标本量较少及存在抑制因子所致。Amplicor pCR在方法学上仍需进一步自动化以避免手工重复操作。

  二、转录介导扩增反应即基因探针扩增直接试验(AMTDT)

  AMTDT是由美国加州Gen-Probe公司发展起来的由DNA介导的等温rRNA扩增法,扩增子应用吖啶酯(acridinum ester, AE)标记的化学发光探针(AE-DNA探针)进行核酸杂交保护实验(hybridization protection assay, HPA),通过照度计检测杂交探针的相对发光值(ralative light units, RLU),以RLU≥3×104判断为阳性。该rRNA序列在核酸中存在2×103拷贝数,应用AMTDT可使特异性靶rRNA序列扩增109倍,其检测低限为每ml10个[1~3]。由该公司生产的商品化试剂盒应用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)和十二烷基硫酸钠(SDS)对标本进行消化与去污染处理,且该过程在单管中进行,这样也防止了标本间可能的交叉污染;该试剂盒能直接用于各种临床标本的检测,整个过程仅需5小时便可完成。与培养法相比,AMTDT检测临床标本敏感性为92.9%~100%,特异性为90.1%~98.7%;结合临床综合判断,AMTDT敏感性、特异性、PPV、NPV分别达83.9%~100%、97.6%~100%、80.7%~100%、96.3%~99.3,其敏感性与培养法相等或稍高[1~3,7,9]。研究表明,AMTDT检测肺外标本(胸腹液,脑脊液)的敏感性和特异性与肺部标本大致相仿(P>0.05),并不低于培养法;把标本量从50μl增加到500 μl,然后进行离心,可明显提高该试验结果的敏感性,而不影响其特异性[7,8]。日本学者Abe等[10]比较了经典PCR和AMTDT检测痰标本结果,发现AMTDT检测总阳性率达91.9%,高于经典PCR法(84.2%)。AMTDT检测未经抗结核治疗临床标本的敏感性高于抗结核治疗者,即随着化疗的进行,象涂片和培养一样AMTDT逐渐阴转,然而,有少数患者持续阳性,考虑可能系死菌核糖体蛋白保护了16SrRNA,而使AMTDT能检测出无力菌中的rRNA,因此,该方法不能用于监测化疗效果[7]。由于AMTDT不能鉴别结核分支杆菌和MOTT,也不能进行药敏试验,因此不能代替传统的培养法[8]。

  三、连接酶链反应(ligase chain reaction, LCR)

  DNA连接酶具有将两条DNA单链连接在一起并与互补链结合的功能。1991年,Barany利用稳定Taq连接酶,借助PCR原理,首先建立了LCR;此后,美国芝加哥Abbott实验室开发出半自动商品化LCR诊断试剂盒(Abbott lCx)[11,12]。LCR扩增的靶序列位于编码蛋白抗原b的染色体基因中,该基因为结核分支杆菌复合群所特有。在LCx扩增体系中,成对设计的四条寡核苷酸探针识别并与之互补的单链结核分支杆菌靶序列(标本制备所暴露的)进行杂交,每对寡核苷酸探针均应用不同半抗原进行标记,一条含有捕获半抗原,用于捕获靶序列;另一条含有检测半抗原,为了检测。当一对探针与DNA一条单链上蛋白抗原b基因靶序列杂交时,在探针之间有几个寡核苷酸的缝隙,聚合酶在寡核苷酸充填这个缝隙起作用,一旦缝隙被充填,连接酶能共价地连接这对探针形成扩增产物,这样,扩增产物的一端含有了捕获半抗原,而另一端则含有检测半抗原,该产物与原有靶序列互补,其本身又可做为下一次扩增循环的靶源,如此往复,靶序列呈指数性增长[11~13]。扩增反应在LCx热循环仪中进行,94℃1秒,64℃1秒,69℃40秒,共37个循环;LCR扩增产物在Abbott lCx分析仪上通过微粒酶联免疫测定法进行检测,以样本荧光率/分界值(标准荧光率×0.30)(S/CO)>1.0为阳性标准。LCx可直接用于临床标本的检测;对临床确诊的结核患者,其检测呼吸道标本的敏感性、特异性、PPV、NPV分别为90.8%~98.97%、98.97%~100%、96.96%~100%、94.7%~99.62%;检测肺外标本之敏感性、特异性、PPV、NPV分别为73.33%、100%、100%、97.06%;其敏感性(89.36%~90.8%)较培养法(82.9%~88.2%)和涂片法(78.72%)均高[11,12]。晚近,挪威学者Lindbrathen等[13]应用LCR检测482份临床标本,与培养相比,其检测涂阳标本、涂阴标本的敏感性分别为96.7%、72%;结合临床综合判断,其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为90.7%、99.2%、97.4%、96.7%;此外,14份MOTT培养阳性标本LCR均为阴性,其中包括2份海鱼和溃疡分支杆菌培养阳性的标本,提示LCR对结核分支杆菌复合群最具特异性。LCR具有以下特点:(1)快速:5小时内可出结果;(2)检测呼吸道和非呼吸道标本均具有高度敏感性和特异性;(3)可进行分支杆菌菌型鉴定:涂片阳性而LCR阴性则提示为MOTT感染,不必等待培养结果;(4)污染少:该扩增系统是完全密闭的,因此,不存在交叉污染或携带污染;(5)LCR可检出无活力菌中DNA,因此,不适合于化疗的随访;(6)LCR要求整个靶序列必须已知,一个核苷酸的错配,可阻止两条单链的连接,因此,LCR可准确检测基因序列中单个基因突变。

  四、链替代扩增反应(strand displacement amplification, SDA)

  SDA是一种新的等温体外DNA扩增方法,1992年由美国学者Walker等[14]首先建立,基本原理如下:靶DNA序列经加热变性后,引物与其对应DNA单链杂交(退火),在聚合酶作用下产生带HincⅡ识别位点含5′和3′末端的靶DNA序列,该靶序列进入SDA循环。首先由HincⅡ限制性核酸内切酶切割识别位点,依赖DNA聚合酶在切割处延伸3′端,并替代另一条DNA链;该替代链与引物杂交后又依次做为另一扩增反应的靶源,这些步骤在反应体系中不断重复,使靶DNA序列呈指数性增长;37℃~40℃23次循环后,2小时内靶序列可得到108扩增。扩增产物经生物素标记DNA探针杂交后应用化学发光酶联免疫试验进行检测,其检测纯化DNA低限为5~50个基因拷贝数[15]。1994年,Walker等[15]进一步对SDA进行了改良,应用SDA同时扩增两个靶DNA序列(16S rDNA序列和IS6110序列)和一个内对照靶序列,即复合SDA(mSDA)系统,通过接合器(adapter)介导在不同靶序列末端连接上共同引物序列,这样一对引物便扩增了不同靶序列,从而,有助于鉴别结核分支杆菌和MOTT。Badak等[16]应用mSDA检测分支杆菌生长指示试管(MGIT)培养系统中结核分支杆菌和MOTT,敏感性为97.2%,特异性96.1%。有作者应用SDA扩增IS6110序列检测294份痰标本,敏感性达95%~100%,特异性为84%~98%[17]。日本Ichiyama等[18]对半自动BDProbeTec-SDA系统和Amplicor pCR检测痰标本中分支杆菌进行了比较,结果显示,SDA和Amplicor pCR检测结核分支杆菌培养阳性标本之敏感性分别为94.7%和89.5%,特异性分别为99.8%和100%;29份鸟复合型分支杆菌(MAC)培养阳性标本中,SDA阳性24份(敏感性82.8%),Amplicor pCR阳性23份(敏感性79.3%),特异性分别为98.3%和100%;该SDA系统可同时扩增48份临床标本,且整个过程仅需6小时。SDA和PCR一样受共同实验条件和参数如靶序列长度、靶序列dGdC含量、引物序列、细菌裂解技术等的影响,因此,也给该扩增技术带来了一定的局限性。

  五、QB复制酶扩增法

  QB复制酶是源于QB噬菌体中的RNA依赖的RNA聚合酶,该酶具有复制限制性RNA分子的作用。1994年,美国学者Shah等首先建立QB复制酶扩增法,接着用于检测结核分支杆菌的研究[19]。其基本原理如下:首先合成两条单链与结核分支杆菌23S rRNA 5′区域相同靶序列互补的捕获探针A和B,设计一条含有与23S rRNA一个区域相互补的检测探针;在扩增前应用可逆性靶捕获技术(RTC)去除标本基质中可能的抑制因子,降低MOTT非特异性竞争作用,提高扩增的特异性。RTC的具体步骤如下:首先捕获探针A、检测探针与靶序列进行杂交,形成的三重杂交子被一含有反配体的顺磁性颗粒所捕获,经洗脱后释放出检测探针-靶杂交子;该杂交子又与捕获探针B进行杂交,所形成的捕获探针B-检测探针-靶三重杂交子被另一顺磁性颗粒捕获、洗脱后重新被释放,接着,该三重杂交子再连续地经过两次捕获、洗脱过程,最终释放出的检测探针-靶杂交子或检测探针经QB复制酶扩增后呈指数性增长,在3~6.5小时内靶RNA序列可得到109扩增。扩增产物应用荧光计进行检测;该方法可检出103纯化结核分支杆菌rRNA,相当于每反应管<1 cFU,检测痰标本低限为10~100 CFU/5 ml[19~21]。Shah等[20]应用手工QB复制酶扩增法检测临床标本,与培养法相比,其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为97.1%、96.5%、80.5%、99.5%;根据临床确诊结果,其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为97.3%、97.8%、87.8%、99.5%,敏感性高于培养法(91.9%)。最近,美国Gene-Trak公司制造出全自动QB复制酶扩增包装试剂盒;Smith等[21,22]应用该试剂盒检测冷冻痰标本,其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为79%、98%、97%、85%;同时对780份临床呼吸道标本(痰、BALF)进行了检测,其敏感性为84%,特异性达97%。QB复制酶扩增法具有以下优点:(1)快速:3~6.5小时可得结果;(2)特异性强:仅结核分支杆菌rRNA扩增反应阳性,而MOTT和其它细菌RNA均得不到扩增;(3)结果不受标本中抑制剂的影响:痰或其它临床标本在扩增前经RTC技术使探针-靶序列得到高度纯化,4个循环后,可使抑制剂降低1012~1016倍;这样,在扩增时可允许多量标本进行检测,因此,QB复制酶扩增法更适合于检测涂阴培阳标本。由于该方法所扩增的模板为23S rRNA,其在死菌中同样可能受到核糖体蛋白的保护而稳定一段时间,因此,QB复制酶扩增法能否用于化疗效果的监测仍有待进一步探讨。

  六、结语与展望

  综上所述,核酸扩增技术以其敏感、特异、快速、简便向人们充分展示了其在结核病临床诊断中的巨大优越性。Amplicor pCR和AMTDT已在国外临床微生物学实验室普遍开展应用,并取得了令人满意的效果。由PCR衍生的几种新的分子诊断技术(LCR、SDA、QB复制酶扩增法等)正逐步由实验室过渡到临床。核酸扩增技术是一种新兴的发展中的诊断技术,在不少方面仍有待改进与完善,如方法学上进一步自动化、简单化,优化实验条件与参数,不断改进检测手段,拓宽应用范围(分支杆菌菌型鉴定、药敏试验、化疗效果的监测等),开发更为实用的标准化试剂盒等。随着分子生物学的不断发展,相信该技术不久将成为诊断结核病的常规方法。

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