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胰腺癌p16基因mRNA异常表达的研究

来源:论文汇编 作者:自动采集 2005-1-1
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摘要: 我们应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测胰腺癌中p16基因mRNA的表达情况,同时应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)对其异常表达的原因进行分析,现将结果报道如下。对象:新鲜胰腺癌组织10例取自中国医科大学第一临床学院普通外科手术切除的肿瘤标本,其中胰头癌9例为胰头十二指肠手术切除,胰体尾癌1例......



  我们应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测胰腺癌中p16基因mRNA的表达情况,同时应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)对其异常表达的原因进行分析,现将结果报道如下。

  一、材料和方法

  1.对象:新鲜胰腺癌组织10例取自中国医科大学第一临床学院普通外科手术切除的肿瘤标本,其中胰头癌9例为胰头十二指肠手术切除,胰体尾癌1例为胰体尾切除术切除。正常胰腺组织7例为对照,取自十二指肠乳头癌和胆管末端癌行胰头十二指肠切除的正常胰腺。

  2.DNA和RNA的提取:酚-氯法提取上述样品DNA,紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度;新鲜冰冻标本50~100 mg样品,用无菌剪刀剪碎,小心移入匀浆器内,加2.5倍体积Trizol,冰上加等体积异戊醇混匀,12 000 r/min离心30 min,弃上清;体积分数为70%乙醇漂洗沉淀2次,干燥,溶于200 μl去离子水;电泳观察结果;用紫外分光光度计测定RNA浓度,-20℃保存备用。

  3.RT-PCR:(1)逆转录合成cDNA:逆转录体系为20 μl。在EP管内依次加入5 μl RNA样品,1 μl 50 mmol/L OligodT(12~15),6 μl 15倍酶缓冲液,1.5 μl dNTPs,20 U AMV逆转录酶。逆转录条件为室温10 min,42℃ 1 h,85℃ 5 min,4℃ 15 min。(2)PCR扩增 取5 μl逆转录产物进行PCR扩增。用RNA样品作为模板直接扩增作为阴性对照,以排除因为DNA污染引起的假阳性结果。所用引物为p16s9-GGAGCATGGAG;p16s13-GGCCCTGTAGGATTC(引物序列由大连宝生物公司合成),应用PTC-200扩增仪(MJ公司)。反应体系由25 μl组成,其中包括RNA样品5 μl,引物2 μl,5%二甲基亚枫1 μl,dNTP 1 μl,10×PCR。反应缓冲液2.5 μl和1 UTaq DNA聚合酶(dNTP PCRbuffer和Taq酶皆购自Biostar Company,Canada)。反应条件95℃ 6 min,68℃ 30 s,72℃ 2 min 1个循环;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 2 min 45个循环;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 10 min 1个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色观察[1]。

  4.PCR-SSCP:(1)以上述方法提取的DNA样品为模板,扩增p16基因第1外显子和第2外显子片段[2]。以β-球蛋白基因为内参照。以正常胰腺组织提取DNA为阳性对照,每次扩增都设置阴性对照。反应体系及反应条件同上述扩增。(2)单链构象多态性分析PCR扩增产物,外显子1为340 bp,外显子2为509 bp。外显子2扩增产物经限制性内切酶SmaI酶切,37℃温箱中过夜,将外显子2片段切割成249 bp和260 bp 2个小片段。取扩增产物8 μl置于96℃加热6 min,立即放于冰水混和物中,使DNA变性为单链。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h,电泳结果用体积分数为7.5%乙酸固定10 min,去离子水漂洗3次,每次2 min,加入硝酸银溶液轻轻晃动5 min,弃银溶液后用去离子水漂洗10 min,加入显影液振荡直至染色条带出现,7.5%乙酸终止反应,观察结果[3]。

  5.统计学分析:Fisher精确概率法。

  二、结果

  10例胰腺癌组织中有4例检测出p16基因mRNA正常表达,6例mRNA不表达,异常表达率达60%。对照组胰腺组织7例均检测出p16基因mRNA正常表达。我们对mRNA未表达的6例胰腺癌进行PCR-SSCP检测,结果其中4例发生了第2外显子的纯合性缺失,有1例发生了第1外显子的突变,第2外显子缺失率40%,对照组7例均未发现第1和第2外显子的缺失和突变。

  三、讨论

  p16蛋白与CDK4竞争性的抑制cyclinD-CDK4复合物的形成,使视网膜母细胞瘤蛋白(Rb蛋白)不能正常的磷酸化,无法释放转录因子,从而抑制了细胞周期G1-S期的转变,抑制了CDK4的促细胞增殖作用。如果p16基因发生了异常改变则丧失了对细胞周期的抑制功能,导致正常细胞周期的失控,细胞发生不可逆的分裂增殖,导致肿瘤的形成。

  p16基因mRNA的表达情况决定了p16蛋白的表达。我们应用RT-PCR技术检测了10例胰腺癌和7例正常胰腺组织中p16基因mRNA的表达情况,统计学分析表明两者之间相比差并有显著性(P<0.05),p16基因mRNA的异常表达与胰腺癌的发生关系密切。p16基因第2外显子的缺失是引起mRNA异常表达的重要原因,但mRNA异常表达率超过了其DNA水平的缺失和突变率,表明除了缺失和突变尚有其他引起p16基因mRNA异常表达的原因。

  参考文献

  1,Micheal Naumann, Natalia Savitskaia, C-hristina Eilert, et al.Frequent Codeletionof p16/MTS1 and p15/MTS2 and Genetic Alterations in p16/MTS1 in Pancreatic Tumors. Gastroenterology, 1996,110:1215-1224

  2,Kamb A, Gruis NA,Feldhaus JW, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science, 1994,264:436-439.

 


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