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培养的星形胶质细胞反应性胶质化的研究

来源:论文汇编 作者:自动采集 2005-1-1
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摘要: 我们利用分离培养的星形胶质细胞(astricyte, ast)建立体外反应性胶质化模型,并在此基础上研究损伤Ast反应的发生、发展及其特点。一、材料与方法新生当天大鼠,取皮层组织常规制成细胞悬液,转入含胎牛血清的DMEM培养瓶中,37℃、体积分数为5%CO2孵箱培养24 h,细胞贴壁后换液。待细胞生长至约80%融合后,质量分数为0。2......



  我们利用分离培养的星形胶质细胞(astricyte, ast)建立体外反应性胶质化模型,并在此基础上研究损伤Ast反应的发生、发展及其特点。

  一、材料与方法

  新生当天大鼠,取皮层组织常规制成细胞悬液,转入含胎牛血清的DMEM培养瓶中,37℃、体积分数为5%CO2孵箱培养24 h,细胞贴壁后换液。待细胞生长至约80%融合后,质量分数为0.25%胰酶消化细胞、传代,重复传3~4代,Ast纯度超过95%。

  将Ast消化后接种在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上24孔板中,Ast生长达80%~90%融合后,用无菌血管钳夹持自制消毒橡皮头,在盖玻片上不同部位轻轻点搓3~4次,造成Ast损伤。用D-Hank's液清洗培养物,去除损伤的细胞碎片,补加新鲜培养基继续培养,倒置相差显微镜下观察Ast对损伤的反应。

  提取细胞总RNA,将细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA,取适量产物进行聚合酶链(PCR)反应。设计合成引物2对,胶原纤维酸性蛋白(GFAP)引物上游序列为5′CTGAATTCTGCT-GGCTTCAAGG-3′,下游序列5′-CTAA-GCTTGCTCTGCGTTGCGG-3′,扩增片断长624 bp。β-actin引物上游序列为5′-GCGGGAAATCGTGCTGACATT-3′,下游序列为5′-GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGT-G-3′,扩增片段长314 bp。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测,长波紫外灯下观测并照相,以β-actin作为内对照,紫外分光光度计分析目的基因的表达。

  取生长于盖玻片上的正常与损伤的Ast,固定后按本室常规方法进行免疫细胞化学及原位杂交分析。

  二、结果

  纯化培养的Ast呈大致均一的单层扁平、多角形细胞,具有短而粗大的细胞突起,GFAP免疫细胞化学染色阳性。

  RT-PCR分析结果表明,Ast损伤后1 d,GFAP mRNA表达水平即明显升高,5~7 d后升高最明显,而正常Ast GFAP mRNA表达无显著变化;原位杂交结果表明,Ast损伤1 d后,GFAP mRNA的表达即明显增高,杂交阳性物质主要分布在胞浆内,3~4 d后,GFAP mRNA表达进一步增高,在细胞突起中也可见到阳性物质;免疫细胞化学染色提示,Ast划伤24 h后,细胞体积增大,突起粗大,GFAP免疫细胞化学染色增强,3~5 d后细胞突起彼此交织,形成网状聚集,GFAP免疫细胞化学染色明显增强;图像分析结果表明,损伤Ast的细胞面积、平均突起长度、数量与正常Ast比较,差异有显著性(P<0.05)。

  三、讨论

  我们通过对培养的Ast在盖玻片上多点划伤,成功复制了体外Ast反应性胶质化模型。损伤的Ast表现出典型的反应性胶质化特征,即损伤的Ast胞体肥大、突起增粗、延长,RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学染色等均证实GFAP的表达上调。我们认为Ast纯化培养比较容易,可以形成能传代的二倍体细胞系;Ast在培养基中生长稳定,不易自发转化,保持了在体情况下的生理功能和对外界因素刺激的良好反应性;纯化培养的Ast既无神经元存在,又消除了在体情况下各种因素对Ast的影响,Ast对损伤的反应基本反映了其自身的性质和机能状况。而且,对Ast施加的各种干扰因素也很容易控制。

  基金项目:全军九五面上项目(96M090)

 


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