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感觉和运动神经来源的雪旺细胞p75受体表达的研究

来源:论文汇编 作者:自动采集 2005-1-1
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摘要: 【摘要】目的研究感觉神经和运动神经来源的雪旺细胞(Sc)表达低亲和力受体(p75)的情况。方法结合酶消化、阿糖胞苷处理和S-100免疫荧光鉴定,从5d龄SD乳鼠背根神经和股神经得到感觉和运动神经来源的Sc。2种细胞分别进行普通培养基和添加高浓度白细胞介素(IL)-1培养基的培养,检测不同时间Sc表面神经生长因子p75的表达情况。......



  【摘要】 目的 研究感觉神经和运动神经来源的雪旺细胞(Sc)表达低亲和力受体(p75)的情况。方法 结合酶消化、阿糖胞苷处理和S-100免疫荧光鉴定,从5d龄SD乳鼠背根神经和股神经得到感觉和运动神经来源的Sc。2种细胞分别进行普通培养基和添加高浓度白细胞介素(IL)-1培养基的培养,检测不同时间Sc表面神经生长因子p75的表达情况。结果 感觉和运动Sc普通培养基组p75受体表达方式明显不同,前者在第5d迅速达到峰值(1086.39±535.16),而后者在同期呈低水平(410.50±326.55,P<0.05);而添加IL-1组2种细胞的表达基本一致,均在第5d达到峰值(891.50±406.10、922.32±520.25,P>0.05)后均迅速下降。结论 2种神经来源的Sc表达p75受体存在差异,提示Sc在再生过程中存在感觉性和运动性的差异。

  Study on p75 receptor expression of Schwann cells of sensory and motor nerve origin

  QIN Yu, GU Liqiang, DONG Wenqi.

  ()Department of Traumatic Orthopaedics, Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guanzhou 510515, China

  【Abstract】 Objective To study the p75 expression of Schwann cells (Sc) derived from sensory and motor nerves.Methods Sc derived from dorsal root nerve or femoral nerve were taken in 5 day old SD rats and cultured in DMEM/F12, 10% FCS media with or without high-dosage Interteukin (IL)-1 added. The expression of p75 was detected by using immunofluorescent method at indicated time points.Results Without IL-1 in media, the expression patterns of two groups of Sc were different. Sensory Sc displayed a peak expression at 5th day, and at the same time, the expression of motor Sc was relatively lower (P<0.05). In the presence of IL-1 in media, the curves of p75 expression tended to be alike, and it reached the peak at 5th day (P>0.05) and went downwards.Conclusion There is a biological difference between sensory and motor Sc, indicating a difference in sensory and motor exists in specific regeneration of peripheral nerves.

  【Key words】 Schwann cell; Motor; Sensory; Interleukin-1; p75 receptor

  在神经损伤后雪旺细胞(Sc)重新增殖、分化,重新包裹轴突的过程中,Sc是否有感觉性雪旺细胞(SSc)和运动性雪旺细胞(MSc)之分如果这样,则有助于我们理解神经特异性再生。由于Sc及神经元表面均有低亲和力(p75)受体表达[1],那么在再生过程中,Sc和神经元可能同时受到来源于末端靶器官和自身分泌的神经生长因子(NGF)的作用,研究p75的表达可以反映二者之间的作用关系。我们通过添加明显高于病理水平的高浓度白细胞介素(IL)-1 (10000U/L)公司观察SSc和MSc的p75表达的反应性,旨在探索2种Sc的p75受体表达的规律,为解释特异性再生提供依据。

  材料和方法

  1.细胞培养[2]:无菌取5d龄SD乳鼠的背根神经和股神经运动支,解剖显微镜下剔除结缔组织和神经外膜,剪碎后加入质量分数为0.25%胰蛋白酶(Sigma公司)和质量分数为0.25%胶原酶(Sigma公司),37℃消化40min,细胞悬液接种于预先包被浓度为1g/L的多聚赖氨酸(Sigma公司)的Petri培养皿,孵育箱中培养(37℃,体积分数为5%CO2)。培养基含有体积分数为90%DMEM/F12(1∶1)(Gibco公司)、体积分数10%小牛血清、25mmol/L HEPES(Sigma公司)及青、链霉素。48h后加入10-5g/L的阿糖胞苷(Ara-C)处理2d。

  2.细胞免疫荧光、碘化丙啶双重染色:细胞鉴定及受体检测使用免疫荧光染色技术,用碘化丙啶双重标记目的是确定细胞轮廊,便于计算每个细胞的荧光值。以检测p75受体步骤为例:倾去Petri培养皿中的培养基,磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤,体积分数为1%多聚甲醛固定15min,PBS洗涤,1∶50羊抗鼠p75受体抗体(武汉博士德)50μl,90min(37℃),PBS洗涤,1∶50兔抗羊异硫氰酸荧光素标记抗体(IgG-FITC,武汉博士德) 50μl,30min(37℃),PBS洗涤,5mg/L 碘化丙啶50μl,室温20min,PBS洗涤后进行扫描。

  3.受体检测:按上述方法培养的2种Sc,分别接种到8个Petri培养皿,按随机的方法记号为1~8号,将每组的4对培养皿规定单号加入常规培养基,双号为添加10000U/L IL-1(北京邦定公司)的培养基。在培养的第3、5、7、9d按顺序各取1对进行p75受体免疫荧光和碘化丙啶双重染色,方法如上说明。

  结  果

  1.雪旺细胞培养:光镜下根据Sc的典型形态判断,SSc的纯度达到79%,MSc则达到90%;S-100是Sc膜表面表达的特异性蛋白,通过荧光标记的抗S-100单克隆抗体,利用抗原抗体特异性结合的原理,可以识别出Sc。操作方法类似以上p75的检测,只需调整为相应的一抗和二抗。用该法计算SSc的纯度可达87%,MSc可达95%。混杂的细胞一般是成纤维细胞。

  2.受体表达:普通培养条件下,SSc与MSc第3d p75表达的平均水平是接近的,分别为217.63±235.95、252.54±263.91(P>0.05),第5d SSc的p75表达出现峰值,达1086.39±535.16,高出同期MSc 410.51±326.55 2倍以上(P<0.05),其后在第7d(964.46±441.70)、第9d(330.71±205.14)呈下降趋势,而MSc的p75表达曲线则表现较低水平的平直趋势,在第9d(511.31±757.23)超过SSc。

  在添加高浓度IL-1的培养条件下,2种细胞p75表达呈现较一致的趋向,即在第3d均处于较低水平SSc:228.18±222.13、MSc:355.09±312.72,在第5d出现峰值(891.54±406.10、922.32±520.25,P>0.05),其后表达下降,SSc下降较慢,观察期内降至625.75±453.53,MSc则又降至253.80±254.81,P<0.05。

  讨  论

  本实验取自股神经运动支和背根神经组织,通过培养过程中观察细胞形态,抗S-100免疫荧光标记均确定为Sc,因此可以确定我们得到的细胞是感觉神经源和运动神经源性Sc。为探讨二者是否存在差异性,我们进一步从生物学方面进行了研究。在再生过程中,神经元和Sc的作用是交互的。有研究表明,神经离断后3h近端即有轴芽长出,其生长不需要任何基质成分,但延伸速度处于慢相期,方向随机,2d之后,Sc增殖迁出,沿已有的轴突迅速延伸,并超过轴突,此时轴突的生长度进入快相期,而且其生长方向趋向一致[3]。Sc表面的NGF受体主要是p75,这种受体的效应与trk不同,它主要是促进细胞的分化和迁移[1]。

  本实验结果显示,离体培养时,SSc与MSc在常规培养基中p75受体表达的区别提示SSc在较低IL-1浓度时即表现对损伤较高的反应性。Nikam等[4]的研究表明,Sc的p75受体的表达与锌指转录因子Zif268的关系密切,而该转录因子则参与了使静止的、形成髓鞘的Sc转化成易化神经修复的增殖状态的Sc。结合Kojun等[3]的研究,可以推测感觉性神经纤维在再生时会较早接触同性质的胶质细胞,这也与临床病人的感觉恢复较早、较好现象相符;我们在本实验使用含有远高于生理浓度的IL-1的培养基[5],2种细胞的表面曲线近乎一致,说明2种细胞存在共性,也说明对于MSc,可能另有因素影响其p75的表达。本实验的结果初步说明2种来源的Sc在神经再生过程中存在区别,为进一步研究Sc促进神经特异性再生的分子机制打下基础。

  基金项目:国家自然科学基金资助项目(39600149)

  参考文献

  1,Anton ES, Weskamp G, Reichardt LF, et al. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:2795-2799.

  2,严恒林,沈馨亚,刘才栋,等.脊神经来源的人胎儿雪旺氏细胞的体外研究培养.解剖学杂志,1995,18:203-206.

  3,Kojun T, Tanaka HF, Takahashi A, et al. Basic behavior of migratory Schwann cells in peripheral nerve regeneration. Exp Neur, 1996,137:301-308.

  4,Nikam SS, Tennekoon GI, Christy BA, et al. The zinc finger transcription factor Zif268/Egr-1 is essential for Schwann cell expression of the p75 NGF receptor. Mol Cell Neurosci, 1995,6:337-348.

  5,Lindholm D, Heumann R, Meyer M, et al. Inlerleukin-1 regulates synthesis of nerve growth factor in non-neuronal cells of rat sciatic nerve. Nature, 1987,330:658-659.

 


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