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膀胱癌多药耐药的流式细胞术分析

来源:论文汇编 作者:自动采集 2005-1-1
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摘要: 本实验旨在研究流式细胞术(flow cytometry,FCM)在膀胱癌细胞的多药耐药分析方面的作用,现报道如下。细胞株:转导人mdr-1 cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317/PHamdr-1/A由本室保存[1]。人膀胱癌细胞株EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供。转mdr-1基因细胞系EJ/MDR的鉴定:(1)PCR分析mdr-1基因的整合:参照DNAzol dNA提取......



  本实验旨在研究流式细胞术(flow cytometry,FCM)在膀胱癌细胞的多药耐药分析方面的作用,现报道如下。

  一、材料与方法

  1.试剂及仪器:DMEM、DNA提取试剂盒DNAzol、RNA提取试剂盒Trizol为Gibco产品;秋水仙素、甲酰胺、polybrene为Sigma产品;缺口平移系统(nick translation)为Promega产品,尼龙膜为Zeta Probe产品;鲑鱼精DNA购自晶美生物公司;MDR-1 pCR引物P1:5′CCCATCATTGCAATAGCAGC-3′,P2:5′-CTTCAAACTTCTGCTCC

  tGA-3′[1],由军事医学科学院放射医学研究所合成;抗P-gp单克隆抗体JSB1购自福州迈新公司;FITC标记羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术公司;阿霉素由法玛西亚公司福建办事处提供;FCM检测由北京中医研究院西苑医院流式细胞室完成。

  2.细胞株:转导人mdr-1 cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317/PHamdr-1/A由本室保存[1]。人膀胱癌细胞株EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供。以上细胞均生长于DMEM培养基中,其中含体积分数为10%的胎牛血清和200 mmol/L的L-谷氨酰胺,在体积分数为5%的CO2、37℃培养箱中培养。逆转录病毒转染EJ细胞参照文献[1]进行。

  3.转mdr-1基因细胞系EJ/MDR的鉴定:(1)PCR分析mdr-1基因的整合:参照DNAzol dNA提取说明书提取EJ/MDR-1细胞基因组DNA,取1 μl DNA用于PCR扩增。50μl体系:200 μmol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+,2种引物各0.5 μmol/L,95℃预变性1 min,加Taq酶2 U(Promega公司)。PCR仪上扩增:94℃变性45 s,60℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环后72℃延伸7 min,2%琼脂糖凝胶电泳检测167 bp特异扩增带。(2)外源基因在转染细胞的表达分析:mdr-1基因cDNA探针用StuⅠ酶切质粒PHamdr-1/A获得,DIG缺口平移法标记探针,按Trizol说明书提取细胞总RNA,甲醛变性电泳检测RNA的质量,紫外吸收法定量,按文献[4]进行RNA dotblot。

  4.间接免疫荧光分析:收集对数生长期EJ/Mdr-1及EJ细胞,PBS洗涤、离心2次。调节细胞浓度至1.0×105个/ml,加入P-gp单抗JSB115 mg/L,4℃放置30 min;冷PBS洗2次,加入FITC标记羊抗鼠IgG,FCM检测P-gp蛋白表达;参照文献[3]行抗体稀释及细胞固定,4℃继续放置30 min;冷PBS洗2次后送检。

  5.FCM测定转基因细胞内阿霉素浓度:参照文献[3]进行。MTT法检测EJ/mdr-1细胞对化疗药物的体外敏感性:参照文献[4]进行。

  二、结果

  用PA317/PHamdr-1/A病毒上清转染的EJ细胞,秋水仙素(120 μg/L)加压筛选3周,获得抗性克隆,命名为EJ/mdr-1,培养传代。提取EJ/mdr-1细胞DNA行PCR检测,可特异性扩增出167 bp的mdr-1基因片段,而其亲代EJ细胞则未扩出此片段,从而证实有mdr-1基因的整合。提取已转导mdr-1基因的EJ细胞RNA,Dotblot结果证实EJ/mdr-1细胞中有mdr-1mRNA表达。mdr-1在EJ及EJ/mdr-1的阳性表达率分别为(7.5±2.1)%和(19.6±4.3)%,差异有显著性(P<0.05)。EJ/mdr-1及EJ细胞内阿霉素荧光强度分别为16.85±4.12和5.59±3.65,差异有显著性(P<0.05),MTT法检测发现,EJ/mdr-1细胞对阿霉素、秋水仙素的耐药倍数分别是其亲代EJ细胞的7.2倍和9.5倍,差异均有显著性(P<0.01)。

  三、讨论

  我们采用逆转录病毒介导将mdr-1基因转入人膀胱癌细胞株EJ,经PCR、Dotblot检测证明mdr-1基因的整合及mRNA水平的表达,FCM结果表明转染细胞的P-gp表达也有提高,并最终导致细胞内药物浓度下降,对阿霉素、秋水仙素等亲脂性化疗药物的敏感性降低,说明膀胱癌的多药耐药性与MDR基因及其产物的P-gp过表达有关。

  基金项目:福建省卫生厅青年基金资助项目(Q9702)

  参考文献

  [1]Feng K,Pei xT,Wang LH,et al.Priliminary study ofretroviral mediated transfer of the human mdr-1 gene into murine and human hematopoietic stem/progenitor cells.Chin Cancer res,1997,9:268-271.

  [2]Yang JM,Goldenberg S,Gottesman MM, et al.Characteristics of p388/VMDRC.04,a simple,sensitive model for studying P-Glycoprotein antagonists. cancer Res,1994,54:730-737.

  [3]郑国强,韩济生,刘叙仪,等.人胃腺癌阿霉素耐药细胞系BGC-823/DOX耐药机理的研究.中华外科杂志,1997,36:325-328.

  [4]Stein U,Walther W,Shoemaker RH.Reversal of multidrug by transduction of cytosine genes into human colon carcinoma cells.J National Cancer institute,1996,88:1383-1391.

 


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