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蛋白激酶C在哮喘炎性细胞及介质中的作用

来源:论文汇编 作者:自动采集 2005-1-1
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摘要: 支气管哮喘是有多种炎性细胞参与的气道慢性非特异性炎症,发病过程中多种炎性细胞释放各种炎性介质引起气道损伤,造成气道高反应性。在细胞因子和炎性介质释放的过程中,细胞信号转导通路的作用十分重要,其中尤以蛋白激酶C(PKC)信号转导通路的作用最引人注目。一、蛋白激酶C的生化特征PKC是一个磷脂依赖性蛋白丝氨酸/苏......



  支气管哮喘是有多种炎性细胞参与的气道慢性非特异性炎症,发病过程中多种炎性细胞释放各种炎性介质引起气道损伤,造成气道高反应性。在细胞因子和炎性介质释放的过程中,细胞信号转导通路的作用十分重要,其中尤以蛋白激酶C(PKC)信号转导通路的作用最引人注目。

  一、蛋白激酶C的生化特征

  PKC是一个磷脂依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族,包括至少十二个亚型,分为三大类[1]:传统PKC(cPKCs):包括PKC-α、PKCβⅠ、PKC βⅡ、PKC γ,其活化依赖于磷脂酰丝氨酸(PS)存在,由Ca++和二酰甘油(DAG)激活;新PKC(nPKCs):包括PKCδ、PKC ε、PKC η、PKC θ、PKC μ,其活化需要PS和DAG的存在;但不需要Ca++参与;非典型PKC(aPKCs):包括了PKCζ、PKC ι、PKC λ三种异构体,活化需要PS,但不需要Ca++和DAG。在不同的组织器官中,各PKC亚型的分布也不尽相同,各亚型因酶特性、组织表达、特异性细胞内定位不同而功能有所差异[2]。

  PKC的结构可分为5个可变区(V1~5)和4个固定区(C1~4)[2]。V3区包括了一个蛋白酶敏感的“绞链”区,在此区特定位点断裂,可以将酶分为两个部分:氨基端调节区和羧基端催化区,调节区包括Ca++、PS、DAG(或phorbol ester)的结合位点;分离的催化区称为蛋白激酶M(PKM),包含有ATP结合位点和激活位点。

  调节区包括[2]C1、C2区,催化区包括C3、C4区。C1区中包含有DAG和phorbol ester的结合位点,还包含了与底物氨基酸序列类似的序列,称为伪底物区(pseudosubstrate domain),并被认为是PKC的调节机制所在。在无辅助因子存在时,伪底物区被限定于活化点,从而阻止蛋白底物与PKC结合,因而表现为无活性状态。在Ca++、DAG、PS与PKC结合后引起PKC结构改变,伪底物区与活化点分离,催化位点暴露,使得底物可以与催化点结合,发挥催化作用,表现为活化状态。Ca++的结合位点位于C2区,磷脂的结合位点可能在C1区,ATP的结合位点在C3区。nPKC、aPKC缺乏C2区,这可能是它们活化不依赖于Ca++存在的原因。由于PKC存在以上结构,因此其活化剂和抑制剂均可以分为两类,即作用于调节区类和作用于催化区类。

  细胞膜内外部因素与细胞结合后[1,2],通过多种途径活化磷酯特异性磷脂酶C(PI-PLC),分解膜磷脂,形成DAG,DAG与PKC结合后激活PKC,使PKC的伪底物区与活化点分离而活化,同时从胞浆转位至胞膜,从而发挥其催化蛋白质磷酸化的作用。转位到膜的PKC一部分被蛋白酶水解而失去活性,还有一部分可以从膜再转位至胞浆。PKC的主要作用方式是催化底物蛋白质磷酸化,从而发挥其生理功能。它可以引起多种底蛋白质如离子通道蛋白、离子转运蛋白、磷酯酶、肌动蛋白结合蛋白、ATP酶、其它激酶以及核因子的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化,使其底物蛋白质构象发生改变,从而激活离子交换、Ca++通道、水解膜磷酯、肌丝收缩、使mRNA合成增加等,继而发挥其作用。

  二、PKC与支气管哮喘炎性细胞、炎性介质的关系

  1.肥大细胞:在哮喘的发病过程中,肥大细胞起着关键的作用[3]。肥大细胞在受到IgE介导的刺激后释放炎性介质、细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-8等细胞因子以及胃促胰酶、类胰蛋白酶而引起中性粒细胞、嗜酸细胞(EOS)在肺部募集,破坏肺组织,成纤维细胞及平滑肌细胞增生,从而导致气道重塑。单独使用PKC活化剂使肥大细胞的组胺释放量缓慢增加(120分钟内增加50%);若先用小剂量PKC与细胞孵育,再用其它刺激剂,则组胺释放量剧增;若先用超大剂量PKC活化剂使PKC钝化而丧失酶活性,肥大细胞的组胺释放量显著减少。PKC抑制剂显著抑制大鼠肥大细胞在受体IgE抗体刺激时的组胺释放,抑制程度与PKC抑制剂的剂量相关。人类肥大细胞膜上高亲合性IgE受体膜后信息是通过PKC通道传递的;直接使用PKC活化剂使人类肥大细胞组胺释放量增多,而PKC抑制剂则抑制PKC活化剂的这种作用。PKC抑制剂还可抑制由高亲合性IgE受体介导的免疫性刺激所导致的组胺释放,并抑制花生四烯酸代谢,使白三烯C4/D4及前列腺素D4的生成量明显减少。卟琳醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)是激发人肥大细胞释放包括IL-8在内多种细胞因子的最有效的激动剂。Fecktistor等[4]研究腺苷酸受体活化对肥大细胞IL-8分泌的影响时发现,PMA可以刺激肥大细胞分泌IL-8;单独使用腺苷酸受体活化剂并不能使肥大细胞分泌IL-8,而将腺苷酸受体活化剂乙基咔唑(NECA)和PMA合用则使肥大细胞分泌IL-8的能力显著增强,并认为腺苷酸受体是通过PKC起作用的。PMA引起的肥大细胞产生TNF-α作用被PKC抑制剂[5]所抑制,亦被H1受体拮抗剂所抑制,提示有H1受体参与。将以PMA处理后的淋巴细胞[6]与肥大细胞共同孵育,引起了肥大细胞脱颗粒和释放TNF-α、组胺等细胞因子。同功酶研究表明[7],PKCβ表达增加可以促进IL-2、IL-6 mRNA合成,增加胞浆磷脂酶A2(cPLA2)活性,而PKCε则抑制以上作用,提示PKC β在肥大细胞释放炎症介质功能中起着重要的作用。

  2.淋巴细胞:在哮喘的的发病过程中,T淋巴细胞在哮喘的发病中起着重要作用。哮喘肺组织中T细胞有多种活化标志表达,呈现为活化状态,且与气道高反应性有关。在T细胞的活化过程中,PKC起着极其重要的作用。PKC活化剂诱导IL-2分泌和IL-2R表达,这些均是T细胞增生的标志。T细胞中PKC酶家族的活化还导致淋巴细胞表面分子如淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD+ 3、CD+ 4、CD+ 8、以及其他参与细胞生长分化的内源性底物磷酸化。在抗CD+ 3抗体(anti-CD+ 3Ab)存在时,PMA促进IL-4、IL-5mRNA的表达。在淋巴细胞IL-4的表达、分泌中,PKCθ起着较重要作用,PKC θ抑制剂Terrapin-1可以抑制IL-4的分泌[8]。PKCβ[9]、PKC θ[10]可能是T淋巴细胞活化所必需的,而PKCβ[11]在其分化中也起着重要的作用。在培养的淋巴细胞中,PMA促进了整合素LFA-1与ICAM-1的结合[12]。哮喘患者淋巴细胞[13]总PKC活性表达增加,膜PKC活性百分比亦增加,且哮喘患者的一秒钟用力呼气容积(FEV1)和PKC总活性之间显著相关;组胺、氯化氨乙酰胆碱均可引起淋巴细胞PKC总活性的增加,而鞘氨醇和色甘酸二钠则显著抑制PKC活性,在10 mmol时90%以上PKC活性受抑制,在100 mmol时活性完全受抑制。

  3.EOS:正常情况下EOS占外周血白细胞2%~3%,大多数EOS的密度>1.090,称为正常密度嗜酸细胞(NEo),密度<1.090者,称为低密度嗜酸细胞(HEo)。在正常人EOS中,HEo约占10%,哮喘患者HEo%显著增加。HEo呈高活化状态,产生白三烯C4(LTC4)和超氧阴离子的能力较正常密度和高密度EOS为强。在过敏性疾病和哮喘中,EOS是重要的效应细胞,它通过释放颗粒蛋白、白三烯、细胞因子以及毒性氧化物参与组织损伤和炎症。在EOS的各种反应中,PKC起着信号传递作用。以PMA刺激可以激活PKC并诱发脱颗粒、粘附以及呼吸爆发。PMA可以引起EOS[14]血栓烷A2(TXA2)炎性介质的释放。在对气道上皮通透性的研究中,以未经活化的EOS或PMA单独刺激气道上皮,气道上皮细胞对放射性同位素51Cr的释放无任何变化,而将二者共同使用,则51Cr的释放显著增加[15]。研究表明[16],在哮喘患者血和支气管肺泡灌洗液(BALF)低密度嗜酸细胞中,PKC活性显著增强,同功酶检测显示主要为β异构体。

  4.中性粒细胞:哮喘患者中性粒细胞产生炎性介质的能力明显增加[17]。PKC在中性粒细胞的信号通路中是一个关键的参与者,对中性粒细胞的功能发挥起着极其重要的作用,中性粒细胞呼吸爆发直接与细胞内PKC水平有关。PMA可以引起中性粒细胞呼吸爆发[18],活性氧类大量产生,NH2Cl可以抑制中性粒细胞呼吸爆发,减少活性氧的产生,伴随着PKC活性的下调。PKC抑制剂[18]如星形孢子素和1-(5-异喹啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(H-7)以一种剂量依赖性的方式抑制超氧化物的产生。PKC通过激活还原型辅酶II(NADPH)氧化酶而使中性粒细胞产生超氧离子,在其中PKCβ[19]被认为与中性粒细胞呼吸爆发有关。PMA还可以使中性粒细胞对5羟廿碳四烯酸(5-HETE)转化为5-oxo-ETE的作用显著增强,促进中性粒细胞5-oxo-ETE诱导的中性粒细胞整合素表达和粘附[20];PMA可以激活中性粒细胞粘附分子,从而显著增强自身粘附。PKC抑制剂可以抑制白细胞-内皮细胞粘附,并呈剂量依赖性。在哮喘患者中性粒细胞[21]中,PKC膜活性比例显著增高,我们认为这与中性粒细胞更易被激活有关。

  5.巨噬细胞:哮喘时巨噬细胞抗原递呈能力增强,超氧离子以及细胞因子包括粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNFα、IL-6等的释放增加。支气管肺泡灌洗(BAL)和组织活检表明,哮喘患者肺部巨噬细胞数量增多,反应性增强,呈现为活化型。此时巨噬细胞中PKC出现胞浆至膜的转位、活化[21]。以PMA刺激巨噬细胞,可以使其活性氧如H2O2、的释放增加。在哮喘患者单核细胞中,PMA引起了活性氧的释放增加,以糖皮质激素处理单核细胞,则PMA引起的活性氧释放显著减少[22]。PMA还可以使巨噬细胞释放其它生物活性物质,如TNF-α、TXA2、前列腺素I2(PGI2)等增加,并呈显著剂量依赖性;将巨噬细胞以PKC抑制剂预处理,PMA刺激分泌上述物质的作用被抑制。

  6.嗜碱细胞:嗜碱细胞可以通过释放组胺、IL等多种炎性介质而参与哮喘的发病过程,在这些过程中PKC发挥着信号传递作用。将细胞与抗IgE抗体孵育后,PKC活性明显增强,同时组胺释放量增加,二者之间呈显著正相关,且IgE受体介导的嗜碱细胞PKC活化部分依赖于细胞外钙离子内流。PKC抑制剂[23]可使人类嗜碱细胞组胺、前列腺素D2和白三烯C4等的释放量均显著减少,与PKC抑制剂的剂量呈相关效应。剂量较大时上述物质的释放几乎完全被抑制。PMA可以直接刺激迟发相反应(LPR)肺部嗜碱细胞释放组胺[24]。但有趣的是与淋巴细胞相反,PMA在嗜碱细胞中未能引起IL-4的释放,甚至还抑制了IL-4的分泌[25]。

  毫无疑问,PKC在哮喘的发病中起着重要的作用,其活化引起炎性介质的释放,从而导致哮喘发作和加剧。对PKC活化剂和抑制剂的研究可能有助于发现哮喘治疗的另一条途径,即较小毒性或无毒性抑制剂可能可以应用于哮喘的临床治疗。

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