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抗CyPA自身抗体与SLE关系的探讨

来源:临床检验杂志 作者:陈英剑李… 2009-2-21

摘要: 摘要以rhCyP A为包被抗原,用间接ELISA检测了45例SLE病人血浆抗CyP A自身抗体的IgG、IgA、IgM三种类型,并探讨了此抗体与多项临床指标的相关性。结果显示,IgG、IgA、IgM三类抗CyP A自身抗体的阳性率分别为36%,20%,18%,总阳性率为48%。存在皮肤粘膜损害、白细胞减少、发热、关节痛表现或活动期的SLE病人抗CyP A自身抗......


摘要 以rhCyP A为包被抗原,用间接ELISA检测了45例SLE病人血浆抗CyP A自身抗体的IgG、IgA、IgM三种类型,并探讨了此抗体与多项临床指标的相关性。结果显示,IgG、IgA、IgM三类抗CyP A自身抗体的阳性率分别为36%,20%,18%,总阳性率为48%。存在皮肤粘膜损害、白细胞减少、发热、关节痛表现或活动期的SLE病人抗CyP A自身抗体阳性率显著高于无相应症状或非活动期SLE病人。

An investigation of relation between anti-CyP A autoantibody and SLE

CHEN Yingjian,LI Fangqiu,YU Wei, WU Jianguo

  (Center of Medical Laboratory Science of PLA,Nanjing General Hospital of Nanjing Command,Nanjing 210002)

  Abstract 45 patients with systemic lupus erythematosus(SLE)were studied for IgG,IgA and IgM anti-cyclophilin A autoantibodies using indirect ELISA and rhCyPA as coating antigen.It was investigated that the relation between these antibodies and several clinical indexes.Anticyclophilin autoantibodies were found in 48% of the SLE patients. The positive rate of IgG, IgA and IgM anti-cyclophilin A antibody is 36%, 20% and 18%, respectively. The prevelance of antibodies to CyPA in patients with skin and mucous lesion, leukopenia, fever, arthralgia or active SLE were statistically higher compared with patients without these clinical manifestations or inactive SLE.

  Keywords rhCyP A;SLE;Anti-CyP A autoantibody

  Cyclophilin(CyP)是环孢素A的受体,也是肽脯氨酰顺反异构酶PPIase三大家族成员之一。CyP家族包括多种成员,其中CyP A是含量最多、最主要的一种。它在生物界广泛存在,结构保守,在细胞的生命活动中扮演着重要的角色[1]。以CyP A为靶抗原的自身抗体—抗CyP A自身抗体最早由Harigi等人于1992年发现[2]。研究表明,SLE病人血清抗CyP A抗体阳性率较高,且与疾病的活动性和某些特定的临床表现相关。

  本实验室证实了抗CyP A自身抗体在SLE病人中有较高的阳性率(53.3%[3],50.5%[4]),还发现在其他的自身免疫性疾病也有一定的阳性率,但与前者相比则低得多。尽管不能说此抗体是SLE的特异性抗体,但它的阳性率之高值得重视。对抗体进行分类发现,IgG、A、M三种类型的抗体都存在[5]。本研究检测了45例SLE病人抗CyP A自身抗体的三种类型,并进一步探讨了此抗体与SLE疾病表现和活动性的关系。

  1 对象与方法

  1.1 病人 SLE患者45例,由南京大学医学院附属鼓楼医院免疫科、山东医科大学附属医院风湿免疫科及本院肾脏病科共同提供,均符合1982年美国风湿病学会SLE诊断标准。其中女41例,男4例,平均年龄28.88(12~62)岁,平均病程3.6年(3个月~17.5年)。南京市红十字会中心血站健康献血员40例作为正常对照。

  1.2 标本 静脉取血,肝素抗凝,2小时内离心分离血浆,分装冻存于-20℃备用。避免反复冻融。

  1.3 SLE活动性判断 记录收集标本时病人的临床表现及各项实验室指标,采用补充的Chubick法[6]判断疾病的活动性,≥4分为活动组,≥8分为重度活动组。

  1.4 主要试剂及仪器 (1)rhCyP A:pET11/CyP A转化的大肠埃希菌BL21(DE3)常规培养表达[7]。收集菌体,超声裂解,离心取上清。50%饱和硫酸铵盐析,离心后沉淀用pH 7.8的Tris-HCl溶液溶解,对同种溶液透析,至透析液无NH+4存在。透析后粗提蛋白液行DEAE-Sepharose CL-4B柱层析,收集流穿蛋白,即rhCyP A,冷冻干燥保存。HPLC测得纯度>95%,SDS-PAGE显示为单一条带,分子量与标准CyP A(Boehringer Mannheim公司产品)一致。(2)HRP标记的抗人γ链F(ab′)2μ链F(ab′)2、α链F(ab′)2,为本科自制。(3)酶联免疫检测仪(Bio Rad)。

  1.5 方法 采用间接ELISA。rhCyP A(1 μg/ml)作包被抗原,用10%新生小牛血清封闭。标本1:50稀释,一式三份,同时设阴、阳与空白对照。酶标抗人γ链F(ab′)2μ链F(ab′)2、α链F(ab′)2分别1:800,1:4000,1:1000稀释。加样量均为100 μl/孔,置37℃反应1 h。底物用TMB-H2O2,37℃避光显色10 min,2 mol/L H2SO4终止反应,空白调零,读取450 nm波长吸光度。以正常对照组吸光度的平均值加两倍标准差(

  1.6 统计学处理 采用χ2检验

  2 结果

  2.1 45例SLE病人中22例抗CyP A自身抗体阳性,阳性率为48%,而40例正常对照中只1例阳性,阳性率为2.5%。两者相比差异非常显著(P<0.01)。三类Ig(G、A、M)抗体的阳性率分别为36%(16/45),20%(9/45),18%(8/45)。

  2.2 用补充的Chubick法判断,45例SLE病人中有27例处于活动期,抗CyP A自身抗体阳性率为63%(17/27),与非活动组(28%,5/18)差别显著(P<0.05)。其中重度活动组有12例,抗体阳性率75%(9/12),与非重度活动组(53%,8/15)相比无统计学差异(P>0.05)。SLE病人各项临床表现与抗CyP A抗体的关系见表1。

表1 SLE病人临床表现与抗CyP A抗体的关系

  Table1 Relation between clinical manifestation of SLE and anti-CyP A autoantibody

Clinical manifestation n Anti-CyP A autoantibody
negative cases Positive cases
IgG IgA IgM total (%)
Skin and mucous lesion 24 7 13* 8** 6 17**(70.8)
Vasculitis 7 6 0 1 1 2(26.8)
Arthralgia 12 2 6 5* 5** 10**(83.3)
Nephritis 35 18 12 8 6 17(48.6)
Fever 8 1 6** 4* 3 7*(87.5)
Anemia 18 9 6 5 2 9(50.0)
Leucopenia 12 3 7* 5* 2 9*(75.0)
Thrombocytopenia 15 7 5 5 3 8(53.3)
Hypocomplementemia 29 17 9 8 5 12(41.3)
Positive of ANA 27 12 10 7 6 15(55.6)
Positive of anti-dsDNA 20 8 9 7 4 12(60.0)

  Compared with patients without corresponding clinical manifestation *P<0.05,**P<0.013 讨论

  SLE是典型自身免疫病,病变涉及多种组织与器官,存在多种免疫学异常。其中一典型特征就是体内产生多种针对正常细胞不同成份的自身抗体。这些抗体又对疾病产生这样那样的影响。已证实其中一些自身抗体与特定的疾病表现有相关性[8]。如抗磷脂自身抗体与血栓形成,抗红细胞抗体和抗血小板抗体与溶血性贫血和血小板减少,抗ds-DNA抗体与肾脏病变,抗Sm、抗RNP抗体与雷诺现象和肌炎有关等。

  本研究表明,48%的SLE病人体内产生了抗CyP A抗体,显著高于正常对照组。且此抗体的出现多伴有皮肤粘膜损害、关节痛、发热和白细胞减少,与Harigi报道结果基本一致。活动性SLE病人抗CyP A抗体的阳性率明显高于非活动组,但重度活动组与非重度活动组相比抗体阳性率未发现明显差别。具体到抗体类型来看,发热与IgG、IgA类抗体,皮肤粘膜损害与IgG、IgA类抗体,关节痛与IgM、IgA类抗体关系比较密切。

  抗CyP A自身抗体的产生机制尚未阐明。考虑到CyP A在自然界的广泛存在,有人提出了分子模拟的假说。而由于SLE病人免疫系统的紊乱使之比正常人更易产生抗CyP A自身抗体。虽然说自身抗体对自身免疫病的发生发展意义重大,但大多数自身抗体的作用机理并不清楚。单从抗CyP A抗体来看,它的靶抗原CyP A是一各组织细胞都广泛存在的蛋白质。正常大脑皮层含量最高(2.8 μg/mg蛋白),皮肤含量较低(0.8 μg/mg蛋白)[9],白细胞约含(2.3 μg/mg蛋白)[10],肾脏也在2 μg/mg蛋白以上。从CyP A含量似可考虑白细胞减少与抗CyP A自身抗体有联系,但却无法解释皮肤粘膜损害与抗CyP A自身抗体的相关性。最近我们证实血管内皮细胞CyP A含量丰富(待发表),也未发现此抗体与血管炎有相关性。这或许与CyP A存在主要和次要两种形式,而不同组织细胞中所含比例不同有一定的关系。另外,由于CyP A存在于胞浆内,目前为止尚无抗CyP A自身抗体穿入细胞及特异性CyP A免疫复合物在病变部位沉积的证据,要得出抗CyP A自身抗体参与SLE病人的皮肤粘膜损害、白细胞减少以及关节病变的结论还为时过早。但抗CyP A自身抗体的检测或许可以作为一考察疾病活动性的参考指标。

  *江苏省自然科学基金资助项目

  **第二军医大学硕士研究生

  参考文献

  1 Galat A,Metcalfe S.Peptidyl proline cis/trans isomerases.Proc Biophys Mol Biol,1995,63:67~118

  2 Harigi M,Hara M,Takahashi N,et al.Presence of autoantibodies to peptidyl-prolyl cis-trans isomerase(CsA-binding protein)in systemic lupus erythematosus.Clin Immunol Immunopath,1992,63:58~63

  3 武建国,李晓军,张文辉,等.测定Cyclophilin自身抗体的意义。中华微生物与免疫学杂志,1996,16(1):63~65

  4 张志龙,武建国,李晓军,等.系统性红斑狼疮患者血清抗亲环素A自身抗体及其特异免疫复合物的测定及意义。中国实验诊断学,1997,1(5):26~28

  5 虞伟,李芳秋,赵权,等.CyP A三类Ig自身抗体测定方法的建立与临床应用.临床检验杂志,1998,16(5):262~264

  6 Chubick A,et al. An apprisal of test for native DNA antibodies in connective tissue diseases. Clinical usefulness of Crithdia Luciliae assay.Ann Intern Med,1978,89:186

  7 李芳秋,赵权,武建国,等.重组人亲环素A的表达、纯化及活性测定。微生物学报,1998,38(3):193~196

  8 张卫华,沈福民.系统性红斑狼疮的发病机理.国外医学皮肤性病学分册,1998,24(2):108~111

  9 Ryffel B,Woerly G,Greiner B,et al.Distribution of the CsA binding protein cyclophilin in human tissue.Immunology,1991,72:399

  10 Allain F,Boutillon C,Mariller C,et al.Selective assay for CyPA and CyPB in human blood using highly specific anti-peptide antibodies.J Immunol Methods,1995,178:113~120



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