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孕母血中抗胎儿细胞IgG类抗体酶联免疫检测法的建立

来源:中华医学检验杂志 作者:柳忠辉… 2009-2-21
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摘要: 人绒毛滋养细胞表面存在特异性胎儿细胞抗原位点,针对这些抗原位点的免疫应答,有可能诱发原因不明性流产等病理性妊娠的出现。因此,我们利用纯化的滋养细胞表面抗原,建立了孕母血中抗胎儿细胞IgG类抗体的酶联免疫法(ELISA)测定,用于免疫性流产的特异性诊断。抗滋养细胞膜抗原单克隆抗体的制备见文献[1]。滋养细胞表......


人绒毛滋养细胞表面存在特异性胎儿细胞抗原位点,针对这些抗原位点的免疫应答,有可能诱发原因不明性流产等病理性妊娠的出现。然而,由于缺乏相应的检测手段,国内外尚无有效、特异的免疫性流产诊断方法。因此,我们利用纯化的滋养细胞表面抗原,建立了孕母血中抗胎儿细胞IgG类抗体的酶联免疫法(ELISA)测定,用于免疫性流产的特异性诊断。

  一、材料与方法

  1.抗滋养细胞膜抗原单克隆抗体的制备见文献[1]。

  2.滋养细胞表面特异性膜抗原的纯化:采用制备的混合单克隆抗体(pooled McAb)偶联的亲和层析凝胶,常规亲和层析纯化。

  3.孕母血中抗胎儿细胞抗体间接ELISA检测:取纯化的人滋养细胞抗原1.5 μg/100 μl/孔(以0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释),4℃过夜包被酶标板;以0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)内含0.05% Tween-20,洗涤3次,加入0.04 mol/L pH7.4 PBS稀释的1%Block-Ace,200 μl/孔,4℃封闭过夜;洗涤1次,加入样本稀释液(0.01 mol/L pH7.4 PBS内含0.02%Tween-20和0.1%Block-Ace)稀释的孕母血清(1∶100),100 μl /孔,40℃饱和湿度孵育1小时;洗涤3次,每孔再加入100 μl辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG,40℃饱和湿度孵育50分钟;洗涤3次,加入邻苯二胺(OPD)底物液显色,测定490 nm吸光度(A)。

  二、结果

  正常妊娠及多次不明原因性流产女性外周血中抗胎儿细胞IgG类抗体水平:

  对临床检查未发现异常的40例正常妊娠妇女(平均孕10周),以及具有3次以上不明原因性流产史的妊娠妇女,分别取外周静脉血,分离血清,以建立的间接ELISA法检测孕母血中抗胎儿细胞抗体。结果显示,以正常妊娠女性平均值+3标准差(

  三、讨论

  胚胎滋养细胞是维持胎儿生存最特殊、最重要的细胞之一,因此损伤滋养细胞,将直接影响胎儿的生存环境,进而导致流产、死胎等妊娠并发症的出现。滋养细胞的损伤原因多种多样,诸如感染、药物以及物理性损伤等。近年的研究还表明,在滋养细胞表面存在着特异的胎儿细胞抗原表位和白细胞交叉抗原,针对特异性抗原表位的免疫性应答,有可能导致妊娠妇女发生免疫性流产。但因缺乏特异性诊断方法,国内外仍将免疫性流产归属于“原因不明性流产”范畴。因此,探讨其特异性诊断方法,就成为“免疫性流产”的研究关键。国外学者虽然经过多年的研究,也发现可以采用滋养细胞膜抗原来检测妊娠妇女血中抗胎儿细胞抗体,但因其所用的抗原均是来源于粗制的滋养细胞膜混合抗原2],内含大量的白细胞交叉抗原,导致检测结果的可信度下降,而不能在临床中推广使用。因此,本实验采用特异的抗滋养细胞膜pooled单克隆抗体,利用亲和层析纯化了特异的滋养细胞膜抗原,建立了特异、高敏感度的孕母血中抗胎儿细胞抗体间接ELISA检测法,弥补了国外学者所建立的检测方法的不足。经40例正常妊娠及10例流产妇女外周血中抗胎儿细胞抗体的临床检测显示,该法假阳性率只有5%,而多次流产女性外周血中抗体检出阳性率高达70%。上述资料不仅提示针对胎儿细胞的免疫应答可能是导致免疫性流产的直接原因,而且检测孕母血中抗胎儿细胞抗体水平有助于免疫性流产的特异性诊断。

参考文献

  1柳忠辉,王树和,陈越,等.抗人绒毛滋养细胞单克隆抗体的研制及鉴定.细胞与分子免疫性杂志,1996,12:59-60.

  2Kajino T, MeIntyre JA, Faulk WP, et al. Antibodies to trophoblast in normal pregnant and secondary aborting women. J Reprod Immunol, 1988,14:267-282.



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